DNA-MIKROARRAYS: PROCEDURE OG APPLIKATIONER - BIOLOGI - 2025

En DNA-mikroarray, også kaldet en DNA-chip eller DNA-mikroarray, består af en række DNA-fragmenter, der er forankret til en fysisk understøtning af variabelt materiale, det være sig plast eller glas. Hvert stykke DNA repræsenterer en sekvens, der er komplementær til et specifikt gen.

Hovedmålet med mikroarrays er den komparative undersøgelse af udtrykket af visse gener af interesse. For eksempel er det almindeligt, at denne teknik anvendes til to prøver - en under sunde betingelser og en patologisk - for at identificere, hvilke gener der udtrykkes, og hvilke der ikke er i prøven med tilstanden. Nævnte prøve kan være en celle eller et væv.

Af Paphrag på engelsk Wikipedia (Overført fra en.wikipedia til Commons.), Via Wikimedia Commons

Generelt kan ekspressionen af ​​gener påvises og kvantificeres takket være brugen af ​​fluorescerende molekyler. Manipulationen af ​​chipsene udføres i de fleste tilfælde af robot, og et stort antal gener kan analyseres samtidig.

Denne nye teknologi er nyttig til en lang række discipliner, fra medicinsk diagnostik til forskellige molekylærbiologiske studier inden for områderne proteomik og genomik.

Hvad består det af?

DNA (deoxyribonukleinsyre) mikroarrays er et sæt specifikke DNA-segmenter bundet til en fast matrix. Disse sekvenser er komplementære til de gener, der ønsker at blive undersøgt, og der kan være op til 10.000 gener pr cm ².

Disse egenskaber tillader en systematisk og massiv undersøgelse af genekspression af en organisme.

Oplysningerne, som en celle har brug for for at fungere, er kodet i enheder kaldet “gener”. Visse gener indeholder instruktionerne for at skabe essentielle biologiske molekyler kaldet proteiner.

Et gen udtrykkes, hvis dets DNA transkriberes til et mellemliggende messenger-RNA-molekyle, og ekspressionen af ​​genet kan variere afhængigt af transkriptionen af ​​dette DNA-segment. I visse tilfælde kan ændringen i ekspression indikere sygdomme.

Princippet om hybridisering muliggør drift af mikroarrays. DNA er et molekyle, der består af fire typer nukleotider: adenin, thymin, guanin og cytosin.

For at danne den dobbelte helixstruktur, adenin grupper med thymin og cytosin med guanin. To komplementære kæder kan således forbindes med hydrogenbindinger.

Typer af mikroarrays

Med hensyn til strukturen af ​​mikroarrayerne er der to variationer: det skræddersyede komplementære DNA eller oligonukleotider og de kommercielle mikrodæmper med høj densitet fremstillet af kommercielle virksomheder, såsom Affymetrix GeneChip.

Den første type mikroarray tillader analyse af RNA fra to forskellige prøver på en enkelt chip, mens den anden variation er af den kommercielle type og har et stort antal gener (for eksempel har Affymetrix GeneChip ca. 12.000 humane gener) der tillader at analysere en enkelt prøve.

Behandle

RNA-isolering

Det første trin i udførelse af et eksperiment ved anvendelse af mikroarray-teknologi er isolering og oprensning af RNA-molekylerne (det kan være messenger-RNA eller andre typer RNA).

Hvis du vil sammenligne to prøver (sundt vs. syge, kontrol vs. behandling, blandt andre), skal isoleringen af ​​molekylet i begge væv udføres.

Produktion og mærkning af cDNA

Efterfølgende underkastes RNA en omvendt transkriptionsproces i nærvær af mærkede nukleotider, og således opnås det komplementære DNA eller cDNA.

Mærket kan være fluorescerende og skal kunne skelnes mellem de to væv, der skal analyseres. På traditionel måde anvendes de fluorescerende forbindelser Cy3 og Cy5, da de udsender fluorescens ved forskellige bølgelængder. For Cy3 er det en farve tæt på rød, og Cy5 svarer til spektret mellem orange og gul.

Hybridisering

CDNA'erne blandes og inkuberes i DNA-mikroarray for at muliggøre hybridisering (dvs. binding forekommer) af cDNA'et fra begge prøver med den del af DNA, der er immobiliseret på den faste overflade af mikroarrayen.

En højere procentdel af hybridisering med proben i mikroarray fortolkes som en højere vævsekspression af det tilsvarende mRNA.

Systemlæsning

Kvantificeringen af ​​ekspressionen udføres ved at inkorporere et læsesystem, der tildeler en farvekode til mængden af ​​fluorescens udsendt af hvert cDNA. For eksempel, hvis rødt bruges til at markere den patologiske tilstand, og den hybridiserer i en højere andel, vil den røde komponent være den dominerende.

Med dette system kan overekspression eller repression af hvert gen, der er analyseret under begge udvalgte betingelser, være kendt. Med andre ord kan transkriptomet af prøverne evalueret i eksperimentet være kendt.

Larssono, fra Wikimedia Commons

Applikationer

I øjeblikket betragtes mikroarrays som meget kraftfulde værktøjer inden for det medicinske område. Denne nye teknologi tillader diagnose af sygdomme og en bedre forståelse af, hvordan genekspression modificeres under forskellige medicinske tilstande.

Endvidere tillader det sammenligning af et kontrolvæv og et væv behandlet med et bestemt lægemiddel for at undersøge virkningerne af en mulig medicinsk behandling.

For at gøre dette sammenlignes den normale tilstand og den syge tilstand før og efter administrationen af ​​lægemidlet. Ved at studere lægemidlets virkning på genomet in vivo har vi et bedre overblik over dets virkningsmekanisme. Det kan også forstås, hvorfor nogle bestemte lægemidler fører til uønskede bivirkninger.

Kræft

Kræft topper listerne over sygdomme studeret med DNA-mikroarrays. Denne metode er blevet anvendt til klassificering og prognose af sygdommen, især i tilfælde af leukæmier.

Forskningsfeltet for denne tilstand involverer komprimering og karakterisering af de molekylære baser i kræftceller for at finde mønster af genekspression, der resulterer i fejl i reguleringen af ​​cellecyklussen og i processerne med celledød (eller apoptose).

Andre sygdomme

Gennem anvendelse af mikroarrays har det været muligt at belyse de differentielle ekspressionsprofiler for gener under medicinske tilstande af allergier, primære immundefekt, autoimmune sygdomme (såsom reumatoid arthritis) og infektionssygdomme.

Referencer

1. Bednar, M. (2000). DNA-mikroarray-teknologi og anvendelse. Medicinsk videnskabsmonitor, 6 (4), MT796-MT800.
2. Kurella, M., Hsiao, LL, Yoshida, T., Randall, JD, Chow, G., Sarang, SS,… & Gullans, SR (2001). DNA-mikroarray-analyse af komplekse biologiske processer. Tidsskrift for American Society of Nephrology, 12 (5), 1072-1078.
3. Nguyen, DV, Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, RJ (2002). DNA-mikroarray-eksperimenter: biologiske og teknologiske aspekter. Biometri, 58 (4), 701-717.
4. Plous, CV (2007). DNA-mikroarrays og deres anvendelser i biomedicinsk forskning. CENIC Magazine. Biologiske videnskaber, 38 (2), 132-135.
5. Wiltgen, M., & Tilz, GP (2007). DNA-mikroarray-analyse: principper og klinisk påvirkning. Hematology, 12 (4), 271-287.