- Applikationer
- Biokemi
- Auxotrofiske markører
- Ames-testen
- Andre applikationer til Ames-testen
- Udvikling af nye stammer
- Antimutagenesis
- Genotoksiske stofskifteundersøgelser
- Evaluering af mutagener i biologiske væsker
- Referencer
De prototrofer er organismer eller celler, der er i stand til at producere de aminosyrer, der kræver for deres livsprocesser. Dette udtryk bruges generelt i forhold til et bestemt stof. Det er modsat af udtrykket auxotroph.
Dette sidste udtryk bruges til at definere en mikroorganisme, der kun er i stand til at vokse og formere sig i et kulturmedium, hvis der er tilsat et specifikt næringsstof. I tilfælde af prototrof kan den trives uden et sådant stof, fordi det er i stand til selv at fremstille det.
Enkel sammenligning mellem auxotroph og prototroph. Taget og redigeret fra: Akardoust, fra Wikimedia Commons.
En organisme eller en stamme, for eksempel ude af stand til at vokse i fravær af lysin, vil blive kaldt auxotrofisk lysin. Den prototrofiske lysinstamme vil på sin side vokse og reproducere uafhængigt af tilstedeværelsen eller fraværet af lysin i kulturmediet.
Grundlæggende har en auxotrof stamme mistet en funktionel stofskiftevej, der gjorde det muligt at syntetisere et grundlæggende stof, der er essentielt for dets vitale processer.
Denne mangel skyldes generelt en mutation. Mutationen genererer en null-allel, der ikke har den biologiske kapacitet til at fremstille et stof, der er til stede i prototrofen.
Applikationer
Biokemi
Auxotrofiske genetiske markører bruges ofte i molekylær genetik. Hvert gen indeholder de oplysninger, der koder for et protein. Dette blev demonstreret af forskerne George Beadle og Edward Tatum i deres arbejde, der gav dem Nobelprisen.
Denne specificitet af generne tillader kortlægning af biosyntetiske eller biokemiske veje. En mutation af et gen fører til en mutation af et protein. På denne måde kan det bestemmes i de auxotrofiske stammer af de undersøgte bakterier, hvilke enzymer der er dysfunktionelle på grund af mutationer.
En anden metode til bestemmelse af biosyntetiske veje er brugen af auxotrofiske stammer af specifikke aminosyrer. I disse tilfælde udnyttes stammenes behov for sådanne aminosyrer til at tilføje unaturlige aminosyreanaloger af proteinerne i kulturmediet.
F.eks. Substitution af phenylalanin med para-azido-phenylalanin i kulturer af Escherichia coli-stammer, der er auxotrofisk for phenylalanin.
Auxotrofiske markører
Mutationer inden for gener, der koder for enzymer, der deltager i veje til biosyntese af metaboliske bygningsmolekyler, anvendes som markører i langt de fleste genetiske eksperimenter med gær.
Den ernæringsmæssige mangel, der er forårsaget af mutationen (auxotrofi), kan kompenseres ved at tilføre det nødvendige næringsstof i vækstmediet.
En sådan kompensation er imidlertid ikke nødvendigvis kvantitativ, fordi mutationer påvirker forskellige fysiologiske parametre og kan fungere synergistisk.
På grund af dette er der foretaget undersøgelser for at opnå prototrofiske stammer med henblik på at eliminere auxotrofiske markører og reducere bias i fysiologiske og metabolske undersøgelser.
Ames-testen
Ames-testen, også kaldet Salmonella-mutagenesetesten, blev udviklet af Bruce N. Ames i 1970'erne for at bestemme, om et kemikalie er et mutagen.
Det er baseret på princippet om omvendt mutation eller posterior mutation. Det bruger flere stammer af Salmonella typhimurium auxotrophic til histidin.
Kemikaliets styrke til at forårsage mutation måles ved at anvende det på bakterier på en plade, der indeholder histidin. Bakterierne flyttes derefter til en ny histidinfattig plak.
Hvis stoffet ikke er mutagent, viser bakterierne ikke vækst på den nye plak. I et andet tilfælde vil de histidine auxotrofiske bakterier igen muteres til prototrofiske histidin-stammer.
Dyrkning af den prototrofiske bakterie Salmonella typhimurium. Taget og redigeret fra: Sun14916, fra Wikimedia Commons
Sammenligning af andelen af bakterievækst i plader med og uden behandling gør det muligt at kvantificere forbindelsens mutagene kraft på bakterier.
Denne mulige mutagene virkning i bakterier indikerer muligheden for at forårsage de samme effekter i andre organismer, herunder mennesker.
Det antages, at en forbindelse, der er i stand til at forårsage en mutation i bakterielt DNA, også kan være i stand til at producere mutationer, der kan forårsage kræft.
Andre applikationer til Ames-testen
Udvikling af nye stammer
Ames-testen er blevet anvendt for at få nye bakteriestammer. For eksempel er der udviklet nitroreduktase-mangelfulde stammer.
Disse stammer bruges til at undersøge xenobiotisk metabolisme og DNA-reparationssystemer. De har også været nyttige til at vurdere de metaboliske mekanismer for nitrogrupper til frembringelse af aktive mutagener såvel som nitreringsmekanismerne for genotoksiske forbindelser.
Antimutagenesis
Ames-testen er også blevet brugt som et redskab til at undersøge og klassificere naturlige antimutagener. Antimutagener er forbindelser, der kan reducere mutagene læsioner i DNA, hovedsageligt ved at forbedre deres reparationssystemer.
På denne måde undgår sådanne forbindelser de indledende trin i kræftudvikling. Siden begyndelsen af 1980'erne (20. århundrede) har Ames et al. Foretaget undersøgelser for at evaluere genotoksinreduktion og kræftrisiko gennem en diæt rig på antimutagener.
De observerede, at populationer, der havde kost med høje niveauer af antimutagener, havde lavere risiko for at udvikle mave-kræft.
Ames-testen er blevet brugt meget til at undersøge forskellige planteekstrakter, der vides at reducere mutagenicitet. Disse undersøgelser har også vist, at plantekomponenter ikke altid er sikre. Det er vist, at mange spiselige planter har genotoksiske virkninger.
Ames-testen har også vist sig at være nyttig til at detektere de toksiske eller antimutageniske virkninger af naturlige forbindelser, der ofte bruges i alternativ medicin.
Genotoksiske stofskifteundersøgelser
En af svaghederne ved Ames-testen var manglen på metabolisk aktivering af genotoksiske forbindelser. Imidlertid er dette problem løst ved tilsætning af CYP-inducerede leverhomogenater fremstillet af gnavere.
CYP er et hæmoprotein forbundet med metabolismen af forskellige stoffer. Denne ændring føjede nye funktioner til Ames-testen. For eksempel er forskellige inducerere af CYP'er blevet evalueret, hvilket viste, at disse enzymer induceres af forskellige typer af forbindelser.
Evaluering af mutagener i biologiske væsker
Disse tests bruger urin-, plasma- og serumprøver. De kan være nyttige til at evaluere dannelsen af N-nitroso-forbindelser in vivo fra aminolægemidler.
De kan også være nyttige i epidemiologiske undersøgelser af menneskelige populationer udsat for erhvervsmutagener, rygevaner og eksponering for miljøforurenende stoffer.
Disse tests har for eksempel vist, at arbejdstagere, der udsættes for affaldsprodukter, har højere niveauer af urinmutagener end dem, der arbejdede i vandbehandlingsanlæg.
Det har også tjent til at demonstrere, at brug af handsker reducerer koncentrationerne af mutagener i støberiarbejdere udsat for polycykliske aromatiske forbindelser.
Urinmutagenerundersøgelser er også et værdifuldt værktøj til antimutagen evaluering, da for eksempel denne test demonstrerede, at indgivelse af C-vitamin hæmmer dannelsen af N-nitroso-forbindelser.
Det tjente også til at demonstrere, at indtagelse af grøn te i en måned reducerer koncentrationen af urinmutagener.
Referencer
- BN Ames, J. McCann, E. Yamasaki (1975). Metoder til påvisning af kræftfremkaldende stoffer og mutagener med salmonella / pattedyr-mikrosom-mutagenicitetsundersøgelse. Mutationsforskning / miljømutagenese og beslægtede emner.
- B. Arriaga-Alba, R. Montero-Montoya, JJ Espinosa (2012). Ames-testen i det 21. århundrede. Forskning og anmeldelser: A Journal of Toxicology.
- Auxotrof. På Wikipedia. Gendannes fra
- S. Benner (2001). Encyclopedia of Genetics. Academic Press.
- F. Fröhlich, R. Christiano, TC Walther (2013). Indfødt SILAC: Metabolisk mærkning af proteiner i prototrofe mikroorganismer baseret på lysinsyntese-regulering. Molekylær og cellulær protein.
- M. Mülleder, F. Capuano, P. Pir, S. Christen, U. Sauer, SG Oliver, M. Ralser (2012). En prototrof deletionsmutantopsamling til gærmetabolomik og systembiologi. Naturbioteknologi.