BIURET: BEGRUNDELSE, REAGENSER, PROCEDURE, ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den biuret er et reagens, der anvendes til proteinbestemmelse lang kæde og kort kæde. Det bruges især inden for analytisk kemi og urinalyse til at undersøge koncentrationen af ​​totale proteiner i serum, plasma og urin.

Proteinværdier kan øges eller formindskes i visse patologier. Hypoproteinemia-symptomer forekommer normalt hos patienter med nyresygdom, hos underernærede patienter og hos patienter med kroniske infektioner.

Kemisk struktur af komplekset dannet i Biuret-reaktionen Positiv Biuret-test. Kilde: Yikrazuul / flickr

Mens hyperproteinæmi observeres i patologier såsom multipelt myelom, systemisk lupus erythematosus, bakteriel endokarditis, bakteriel meningitis, Waldenstroms makroglobulinæmi, blandt andre.

På den anden side skyldes tilstedeværelsen af ​​protein i urinen filtrering af albumin i nyrerne. Dette er patologisk adfærd, der skal studeres.

I denne forstand er Biuret meget nyttig, da det giver mulighed for at kvantificere tilstedeværelsen af ​​proteiner i serum, plasma, urin blandt mange andre prøver.

Selv Biuret kan bruges til at undersøge tilstedeværelsen og koncentrationen af ​​proteiner i dårligt undersøgt prøver eller prøver med ukendt sammensætning. Derfor bruges det vidt på forskningsområdet.

Biuret-testen er baseret på påvisning af peptidbindinger. Testen finder sted i et alkalisk medium. Prøven skal indeholde mindst to peptidbindinger for at danne et violet-lilla kompleks. Komplekset dannes af forbindelsen mellem bindingerne og kobberionen.

Basis

Biurets reagens er sammensat af kaliumhydroxid, kobbersulfat og natrium- og kaliumtartrat. Natriumhydroxid bruges til at alkalisere mediet, da denne tilstand er vigtig for, at reaktionen finder sted.

De stoffer, der reagerer med proteiner, er cupric sulfat, mens natriumtartrat har den funktion at ikke tillade dannelse af kobberhydroxid, der har en tendens til at udfælde og forstyrrer reaktionen.

Hvis der findes stoffer med peptidbindinger (polypeptider eller proteiner) i prøven, vil testen være positiv.

En reaktion fortolkes som positiv, når opløsningen bliver lilla. Farven produceres ved dannelse af et kompleks mellem mindst to peptidbindinger, der har CO-NH-gruppen og de cupriske kationer.

Det violette kompleks kan dannes på to måder: Den ene er ved tab af protoner fra amidgrupperne, der binder til metallet (depronotation), og den anden ved sammenblanding af ilt- og nitrogenelektroner, der er frie og binder med kobber.

Denne reaktion kan variere i intensitet og farve afhængigt af proteintypen.

Testen kan udføres kvalitativt eller kvantitativt. I den kvalitative form rapporteres det som positivt eller negativt. Mens koncentrationen kan måles i den kvantitative form ved hjælp af den spektrofotometriske metode.

Reaktionen læses mellem 540-560 nm. Farveintensiteten er direkte proportional med koncentrationen af ​​peptidbindinger i prøven.

Reagenser

-20% natriumhydroxid (NaOH)

-Cupric pentahydrat 1% (CuSO _4. 5H ₂ O)

-Blandet natrium- og kaliumtartratetrahydrat (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Biuret reagensstabilitet

-Den skal opbevares kølet.

Behandle

Teknik

-Sæt 100 µl af prøven eller standarden, der skal analyseres i et reagensglas.

-Tilsæt 2 ml natriumhydroxid.

-Bland meget godt.

-Tilsæt 5 ml Biuret-reagens.

-Bland og lad hvile i 25 minutter ved stuetemperatur, dæk og beskyt mod lys.

-Besøg formationen eller ej af farve, og mål spektrofotometrisk.

Kalibreringskurve

Bovint serumalbumin kan bruges som standard til at udføre kalibreringskurven. Forskellige koncentrationer fremstilles ud fra det. For eksempel 25, 50, 75, 100, 125 og 150%.

Reaktionen indstilles med alle disse kendte koncentrationer, og absorbansen aflæses ved en bølgelængde på 540 nm. Med dataene om de kendte koncentrationer og absorbansmålingerne foretages kalibreringskurven.

Ved hver bestemmelse eller batch af forarbejdede prøver anbefales det at montere en standard. Bovint serumalbumin 0,1-2 mg / ml kan bruges som en kalibreringsstandard.

Målingerne foretages på et spektrofotometer ved 540 nm.

Linearitet opfyldes op til en koncentration på 12 g / dl.

Interferens

Stoffer, der forstyrrer Biuret-testen

Selvom det ikke er meget hyppigt, skal det bemærkes, at nogle stoffer kan forstyrre under gennemførelsen af ​​denne test. For eksempel kan tilstedeværelsen af ​​ammoniak hæmme farvedannelse.

Ligeledes kunne andre stoffer absorbere ved samme bølgelængde, såsom visse pigmenter.

På den anden side kan der genereres interferens, når et andet stof end peptidbindingen danner et kompleks med det cupriske salt. Eksempel: nogle kulhydrater og visse lipider.

I tilfælde af at prøven, der skal analyseres, indeholder en form for bundfald, skal den filtreres eller centrifugeres, inden testen monteres.

Stoffer, der ikke forstyrrer Biuret-testen

Testen påvirkes ikke af tilstedeværelsen af:

-Bilirubin op til en koncentration på 20 mg / dl.

-Hemoglobin op til en koncentration på 750 mg / dl.

-Extran op til en koncentration på 30 g / L

-Triglycerider op til en koncentration på 4000 mg / dl.

Fordel

-Det er en simpel metode til at udføre.

-Det er en økonomisk test.

-Det har høj specificitet for proteiner.

-Liten forstyrrelse.

Ulemper

Det har dårlig følsomhed til at detektere lave mængder protein. Arbejdet udført af Fuentes et al. Bekræfter, at Biuret-testmetoden har en detektionsgrænse på 1 mg / ml protein og en kvantificeringsgrænse på 3 mg / ml.

Imidlertid rapporterer anden forskning, der udføres på University of Amazonia, meget lavere værdier. Detektionsgrænsen rapporteret af undersøgelsen er 0,020 mg / ml og kvantificeringsgrænsen er 1,33 mg / ml.

Applikationer

Biuret-reagenset eller testen bruges til bestemmelse af proteiner i kliniske og ikke-kliniske prøver i rutine- og forskningslaboratorier.

Patologier, der opstår med en stigning eller fald i

I mange patologier er det vigtigt at bestemme koncentrationen af ​​totale proteiner i kliniske prøver, som kan være forhøjet eller formindsket.

De er forhøjede i:

-Multiple myeloma, -Systemisk lupus erythematosus

-Bakteriel endokarditis, -Bakteriel meningitis, Waldenstroms makroglobulinæmi, blandt andre.

Det mindskes i:

-Negeninsufficiens, -Folk med svær grad af underernæring, -Patienter med kroniske infektioner blandt andre.

Kliniske prøver

De mest almindelige kliniske prøver er serum, plasma og urin. Den normale værdi af proteiner i serum eller plasma er 6,0-8,8 gr / dl.

Koncentrationen af ​​proteiner i urinen hos voksne overstiger ikke tallet 150 mg / 24 timer.

Urinprotein / urin-kreatininforhold normal værdi

Børn: <0,50 mg

Børn over 2 år: indeks: 0,20 mg

Voksne: <0,2 mg

Ikke-kliniske prøver

Biuret-reaktionen kan bruges til mange typer ikke-kliniske prøver, såsom mejeriprodukter, antivenom eller ethvert ukendt stof, som du vil undersøge tilstedeværelsen af ​​proteiner til.

Referencer

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez Y. (2014). Fysisk-kemisk karakterisering og proteinindhold i væskeekstrakter af mangrove østersen (Crassostrearizophorae). Cuban Journal of Chemistry, 26 (1), 66-74. Hentet den 26. juni 2019 fra http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Funktionel karakterisering af mandlen af ​​mangofrø (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67-75
3. "Biuret." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 19. juni 2019, 16:37 UTC. 26. juni 2019, 22:18
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Standardisering af Biuret-metoden til kvantificering af totale proteiner i polyvalent antibotropisk serum produceret ved INS National Center for Biologiske Produkter. Bol - Inst Nac Salud 2012; 18 (11-12). Fås på: repositorio.ins.gob.pe
5. Winer Laboratories. Samlede proteiner. Kolorimetrisk metode til bestemmelse af totale proteiner i serum og plasma. Fås på: wiener-lab.com.ar