HISTOKEMI: BEGRUNDELSE, FORARBEJDNING, FARVNING - BIOLOGI - 2025

Det histokemiske er et nyttigt værktøj i studiet af morfologien af ​​forskellige biologiske væv (planter og dyr) på grund af dets reaktionsprincip for vævskomponenter såsom kulhydrater, lipider og proteiner, blandt andet kemiske farvestoffer.

Dette værdifulde værktøj tillader ikke kun at identificere sammensætningen og strukturen af ​​væv og celler, men også de forskellige reaktioner, der forekommer i dem. Ligeledes kan mulige vævsskader forårsaget af tilstedeværelsen af ​​mikroorganismer eller andre patologier bevises.

Histokemiske pletter. Nilenvirus, Gram-positive og Gram-negative bakterier (Gram), Histoplasma capsulatum (Grocott), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Kilde: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron / CDC / Dr. George P. Kubica

Histokemi fra de forrige århundreder har leveret vigtige bidrag, såsom demonstrationen af ​​eksistensen af ​​blod-hjerne-barrieren af ​​Paul Ehrlich. Dette var muligt, fordi hjernen til det forsøgsdyr, der blev anvendt af Ehrlich, ikke var farvet med anilin, som er et grundlæggende farvestof.

Dette førte til brugen af ​​forskellige farvestoffer såsom methylenblåt og indophenol for at plette de forskellige typer celler. Denne konstatering førte til klassificering af celler til surt, surt, basofilt og neutrofilt, i henhold til deres specifikke farvning.

Nylige undersøgelser har anvendt denne teknik for at vise tilstedeværelsen af ​​forskellige forbindelser, inklusive fenoler, såvel som kulhydrater og ikke-strukturelle lipider, i vævene fra Litsea glaucescens-arten, bedre kendt som laurbær. At finde disse, både i bladet og i træet.

Ligeledes identificerede Colares et al, 2016 planten af ​​medicinsk interesse Tarenaya hassleriana ved hjælp af histokemiske teknikker. I denne art blev tilstedeværelsen af ​​stivelse, myrosin såvel som fenoliske og lipofile forbindelser påvist.

Basis

Histokemi er baseret på farvning af cellulære strukturer eller molekyler, der findes i vævene, takket være deres affinitet med specifikke farvestoffer. Reaktionen af ​​farvning af disse strukturer eller molekyler i deres originale format visualiseres senere i det optiske mikroskop eller elektronmikroskop.

Farvningens specificitet skyldes tilstedeværelsen af ​​ion-accepterende grupper til stede i celler eller vævsmolekyler.

Endelig er formålet med histokemiske reaktioner at være i stand til at vise det gennem farvning. Fra de største biologiske strukturer til det mindste af væv og celler. Dette kan opnås takket være det faktum, at farvestofferne reagerer kemisk med molekylerne i væv, celler eller organeller.

Retsforfølgelse

Den histokemiske reaktion kunne involvere trin forud for udførelse af teknikken, såsom fiksering, indlejring og skæring af vævet. Derfor skal det tages i betragtning, at strukturen, der skal identificeres, kan beskadiges i disse trin, hvilket giver falske negative resultater, selvom den er til stede.

På trods af dette er den forudgående fiksering af vævet, der udføres korrekt, vigtig, da det forhindrer autolyse eller celleødelæggelse. Til dette bruges kemiske reaktioner med organiske opløsningsmidler, såsom formaldehyd eller glutaraldehyd.

Inkluderingen af ​​stoffet gøres således, at det fastholder sin fasthed, når det skæres, og således forhindrer det i at deformeres. Endelig foretages udskæringen med et mikrotom til undersøgelse af prøver ved optisk mikroskopi.

Før det går videre med den histokemiske farvning, anbefales det også at inkorporere eksterne eller interne positive kontroller i hver batch af test. Samt brugen af ​​specifikke farvestoffer til de strukturer, der skal undersøges.

Histokemiske pletter

Fra fremkomsten af ​​histokemiske teknikker til nutiden er der anvendt en lang række pletter, herunder de mest hyppigt anvendte, såsom: Periodic acid Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen og Gram.

Ligeledes er andre farvestoffer blevet brugt mindre ofte, såsom blæk fra Indien, orcein eller Massons trichrome farve, blandt andre.

Periodic Acid Schiff (PAS)

Med denne farve kan molekyler med højt kulhydratindhold observeres, såsom: glykogen og mucin. Det er imidlertid også nyttigt til identifikation af mikroorganismer, såsom svampe og parasitter. Ud over visse strukturer (kældermembran) i huden og andre væv.

Grundlaget for denne farvning er, at farvestoffet oxiderer kulstofbindingerne mellem to nærliggende hydroxylgrupper. Dette frembringer frigivelse af aldehydgruppen, og dette detekteres af Schiffs reagens, der afgiver en lilla farve.

Schiff-reagenset er sammensat af basisk fuchsin, natriummetabisulfit og saltsyre, idet disse komponenter er ansvarlige for den lilla farve, når aldehydgrupper er til stede. Ellers genereres en farveløs syre.

Farvningens intensitet afhænger af mængden af ​​hydroxylgrupper til stede i monosacchariderne. F.eks. I svampe, kældermembraner, muciner og glykogen kan farven variere fra rød til lilla, mens kernerne farves blå.

Grocott

Det er en af ​​pletterne med den højeste følsomhed til identifikation af svampe i paraffinindlejrede væv. Dette gør det muligt at identificere de forskellige svampestrukturer: hyfer, sporer, endosporer, blandt andre. Derfor betragtes det som en rutinemæssig plet til diagnose af mycose.

Det bruges især til diagnose af lungemykose, såsom pneumocystose og aspergillose forårsaget af nogle svampe af henholdsvis Pneumocystis og Aspergillus.

Denne opløsning indeholder sølvnitrat og kromsyre, hvor sidstnævnte er et fikseringsmiddel og farvestof. Begrundelsen er, at denne syre producerer oxidation af hydroxylgrupper til aldehyder med mucopolyacharider, der er til stede i svampestrukturer, for eksempel i svampens cellevæg.

Til sidst oxideres det sølv, der er til stede i opløsningen, af aldehyderne, hvilket forårsager en sort farve, der kaldes argentafin-reaktionen. Kontrastfarvestoffer, såsom lysegrønt, kan også bruges, og svampestrukturerne ses således i sort med en lysegrøn baggrund.

Ziehl-Neelsen

Denne farvning er baseret på tilstedeværelsen af ​​syre-alkoholresistens, delvis eller totalt, i nogle mikroorganismer, såsom Nocardia, Legionella og Mycobacterium slægter.

Anvendelse af denne plet anbefales, fordi cellevæggen i de tidligere nævnte mikroorganismer indeholder komplekse lipider, som hindrer penetrationen af ​​farvestofferne. Især i prøver fra luftvejene.

I det bruges stærke farvestoffer, såsom carbol fuchsin (basisk farvestof), og varme påføres, så mikroorganismen kan fastholde farvestoffet og ikke misfarves med syrer og alkoholer. Endelig påføres en methylenblå opløsning for at farve strukturer, der er blevet misfarvet.

Tilstedeværelsen af ​​syre-alkoholresistens observeres i strukturer farvet rødt, mens strukturer, der ikke modstår falmning, er farvet blå.

Gram og kinesisk blæk

Gram er en meget nyttig plet ved diagnosticering af bakterielle og svampeinfektioner blandt andre. Denne farvning gør det muligt at skelne mellem Gram-positive og Gram-negative mikroorganismer, hvilket tydeligt viser de forskelle, der findes i cellevæggenes sammensætning.

Mens indisk blæk er en plet, der bruges til at kontrastere strukturer, der indeholder polysaccharider (kapsel). Dette skyldes, at en ring er dannet i miljøet, hvilket er muligt i Cryptococcus neoformans.

orcein

Med denne farvning farves de elastiske fibre og kromosomer fra forskellige celler, hvilket tillader evaluering af modningsprocessen for sidstnævnte. Af denne grund har det været meget nyttigt i cytogenetiske undersøgelser.

Dette er baseret på optagelse af farvestoffet ved den negative ladning af molekyler såsom DNA, der er til stede i kernerne i en lang række celler. Så disse er farvet blå til mørk lilla.

Massons trichrome

Denne plet bruges til at identificere nogle mikroorganismer eller materialer, der indeholder melaniske pigmenter. Dette er tilfældet med mycoser, forårsaget af nedbrydende svampe, pheohifomycosis og i sortkorns eumycetom.

Endelige tanker

I de senere år er der sket mange fremskridt i oprettelsen af ​​nye diagnostiske teknikker, hvor histokemi er involveret, men knyttet til andre fundamentaler eller principper. Disse teknikker har et andet formål som i tilfældet med immunohistokemi eller enzymohistokemi.

Referencer

1. Acuña U, Elguero J. Histoquímica. An. Chem. 2012; 108 (2): 114-118. Fås på: are.iqm.csic.es
2. Mestanza R. Frekvens af histokemiske pletter fra PAS, Grocott og Ziehl-Neelsen anvendt til identifikation af mikroorganismer, udført i den patologiske anatomi-service på Eugenio Espejo Specialhospital i 2015.. Det centrale universitet i Ecuador, Quito; 2016. Tilgængelig på: dspace.uce.edu
3. Tapia-Torres N, de la Paz-Pérez-Olvera C, Román-Guerrero A, Quintanar-Isaías A, García-Márquez E, Cruz-Sosa F. Histokemi, samlet fenolindhold og antioxidantaktivitet af litseablad og træ glaucescens Kunth (Lauraceae). Træ og skove. 2014, 20 (3): 125-137. Fås på: redalyc.org
4. Colares, MN, Martínez-Alonso, S, Arambarri, AM. Anatomi og histokemi af Tarenaya hassleriana (Cleomaceae), en art af medicinsk interesse. Latinamerikansk og Caribisk Bulletin over medicinske og aromatiske planter 2016; 15 (3): 182-191. Fås på: redalyc.org
5. Bonifaz A. Grundlæggende medicinsk mykologi. 4. udgave. Mexico: McGraw-Hill Interamericana-redaktører, SA de CV 2012.
6. Silva Diego Filipe Bezerra, Santos Hellen Bandeira de Pontes, León Jorge Esquiche, Gomes Daliana Queiroga de Castro, Alves Pollianna Muniz, Nonaka Cassiano Francisco Weege. Clinico-patologisk og immunohistokemisk analyse af spindelcelle-pladcellekarcinom i tungen: et sjældent tilfælde. Einstein (São Paulo) 2019; 17 (1): eRC4610. Fås fra: scielo.br