LÖWENSTEIN-JENSEN MEDIUM: FOUNDATION, KLARGØRING OG BRUG - BIOLOGI - 2025

Den Lowenstein-Jensen -medium er et selektivt fast medium til isolering og udvikling af bakterier af slægten Mycobacterium, såsom Mycobacterium tuberculosis, M. avium, blandt andre, med undtagelse af leprae art, som ikke er dyrkbar.

Bakterier af slægten Mycobacterium vokser ikke i konventionelle kulturmedier, derfor var det nødvendigt at designe et specielt medium til deres isolering. Det originale medium blev oprettet af Löwenstein og senere modificeret af Jensen.

Löwenstein-Jensen medium med kolonier af Mycobacterium tuberculosis. Kilde: Agarwal et al. / BioMed Central Ltd., høflighed af Biologi-billedbiblioteket

Modifikationen bestod i eliminering af Kongo-røde farvestof, og erstattede det med en højere koncentration malachitgrøn. Det ændrede også koncentrationerne af magnesiumcitrat og monopotassiumphosphat.

Löwenstein-Jensen medium indeholder i øjeblikket kartoffelstivelse, asparagin, magnesiumcitrat, monopotassiumphosphat, magnesiumsulfat, malachitgrønt, nalidixinsyre, cycloheximid, lincomycin, slagne æg, glycerin og vand.

Mycobacteria er normalt isoleret fra steder, der ikke er sterile, såsom sputum, urin, abscesser, blandt andre. Dette betyder, at de fleste af prøverne vil indeholde den sædvanlige mikrobiota i området plus patogenen.

Derfor indeholder Löwenstein-Jensen-mediet en række hæmmere i dets sammensætning repræsenteret af malachitgrøn, antibiotika og svampemidler.

Derudover skal prøver, der kommer fra ikke-sterile steder, dekontamineres og neutraliseres, inden de podes i Löwenstein-Jensen-mediet.

Basis

Tilstedeværelsen af ​​æg og glycerin i Löwenstein-Jensen-mediet stimulerer væksten af ​​mycobakterier, fordi de giver de fedtsyrer og proteiner, der er nødvendige for udviklingen af ​​disse mikroorganismer.

Löwenstein-Jensen-medium indeholder malachitgrønt, som er en hæmmer af den ledsagende mikrobiota. Men den indeholder også nalidixinsyre (35 µg / ml), som hæmmer den Gram-negative mikrobiota, cycloheximid (400 µg / ml), som hæmmer saprophytiske svampe og gær, og lincomycin (2 µ / ml), som hæmmer den Gram-positive mikrobiota.

Nogle kommercielle huse foretrækker at tilføje følgende kombination af antibiotika: polymyxin B 200.000 enheder / l, amfotericin B 10 mg / l, carbenicillin 50 mg / l og trimethoprim 10 mg / l.

Dette medium indeholder ikke agar, derfor opstår størkning af mediet på grund af koaguleringen af ​​albuminet, der er til stede i ægget under sterilisering.

Forberedelse

Vej 37,3 g af det dehydratiserede medium i 600 ml destilleret vand, hvortil 12 ml glycerol tidligere er tilsat. Blandingen opvarmes under omrøring ofte, indtil den er helt opløst. Autoklaver mediet ved 121 ° C i 15 minutter.

På den anden side bør der fremstilles en homogen suspension af 1000 ml friske æg under aseptiske forhold. Tilsæt æggesuspensionen til de 600 ml medium, der er tilberedt ved en temperatur på 50 - 60 ° C, og undgå luftbobler.

Antibiotiske opløsninger tilsættes også efter sterilisering i autoklaven.

Hæld mediet i sterile, skruetrækkede reagensglas. Opvarm rørene ved 85 ° C i 45 minutter i en skrå position.

Farven på det forberedte medium er akvamaringrønt og kan præsentere hvidlige pletter på grund af tilstedeværelsen af ​​æglipider.

PH i mediet skal være 7,2 ± 0,2

Opbevar rør i køleskab og beskyttet mod direkte lys indtil brug. Temperer inden såning.

Der er en modifikation af mediet kaldet "Gruft modifikation af Löwenstein Jensen". Dette indeholder de samme forbindelser som det klassiske medium, men RNA-5 mg / 100 ml tilsættes, og som hæmmere indeholder den malachitgrøn 0,025 g / 100 ml, penicillin 50 U / ml og nalidixinsyre 35 ug / ml.

Applikationer

Löwenstein-Jensen medium bruges til isolering af mycobacteria fra forskellige typer prøver. En Ziehl-Neelsen-plet anbefales til alle eksempler, hvor der er mistanke om tilstedeværelse af mycobakterier.

Nogle prøver kommer fra sterile steder, men andre gør det ikke. Ikke-sterile prøver skal dekontamineres efter behov:

sputum

Sputumprøver skal dekontamineres som følger: bestemmes mængden af ​​sputumprøve i ml og tilsæt den samme mængde 4% NaOH til prøven og inkuber ved 37 ° C.

Ryst blandingen ofte inden for 30 minutter. Efterfølgende centrifuge ved 3000 o / min i 30 minutter.

Kast supernatanten over en fenolisk desinfektionsopløsning. Brug sedimentet til såning, men først skal pH neutraliseres.

At neutralisere sedimentet, 5% H ₂ SO ₄ anvendes i nærvær af phenolen røde indikator, indtil den når en neutral pH, der forårsager en laks farve.

Gastrisk skylning, bronchial skylning og bronchial aspirat

I dette tilfælde skal prøven centrifugeres ved 3000 omdrejninger pr. Minut i 30 minutter. Supernatanten kasseres, og pelleten anvendes. Til dekontaminering af sedimentet tilsættes 3 ml 4% NaOH og omrøres ofte ved 37 ° C i en periode på en halv time.

Centrifuge igen, supernatanten kasseres, og pelleten anvendes. Sidstnævnte skal neutraliseres som forklaret i sputumprøven.

Urin

Lad prøven sætte sig i køleskabet i 24 timer. Adskil supernatanten. Den resterende pellet centrifugeres i 30 minutter ved 3000 RMP. Kasser supernatanten igen og rekonstituer pelleten med 3 ml steril fysiologisk opløsning.

Tilsæt 3 ml 4% NaOH og fortsæt med dekontaminering og neutralisering som beskrevet ovenfor.

Ascites væske, pleural væske, cerebrospinalvæske

I denne type prøver centrifugeres den, og supernatanten kasseres. Udfør et gram på sedimentet eller observer direkte under mikroskopet; Hvis bakterier ikke observeres, er dekontamineringstrinnet ikke nødvendigt, og neutraliseringstrinnet er heller ikke.

I dette tilfælde kan prøven podes direkte ved hjælp af sedimentet. Hvis der er bakterier, skal du fortsætte med at dekontaminere og neutralisere som beskrevet ovenfor.

biopsier

Til denne type prøve skal 5 ml destilleret vand sættes til den senere centrifuge ved 1500 omdrejninger pr. Minut i 10 minutter. Kasser supernatanten, og centrifuger pelleten igen ved 3500 o / min i 30 minutter. Brug sedimentet til at så kulturmediet.

Laryngeal pind

Pinden placeres i et sterilt rør, der indeholder lige store dele destilleret vand og 4% NaOH. Pinden skal presses mod rørets vægge, så prøven fortyndes i væsken. Centrifuger og brug sedimentet. Neutraliser sedimentet som allerede beskrevet.

sået

Löwenstein-Jensen-mediet inokuleres ved tilsætning af 0,5 ml af prøven på overfladen af ​​mediet. Drej røret for at fordele prøven gennem mediet. Brug ikke platinhåndtag.

Et andet rør, der indeholder Stonebrink-medium, kan podes for at isolere Mycobacterium bovis og andre arter, der ikke vokser på Löwenstein-Jensen-medium.

inkubation

De inokulerede rør inkuberes aerobt ved 37 ° C med hætten let løs og skråtstillet ved ca. 5 ° og beskyttet mod lys. Miljøet kan beriges med 5-10% kuldioxid. Kontroller kulturer to gange om ugen, indtil der vises kolonier.

Når prøven er blevet absorberet, strammes hætterne. Den maksimale inkubationstid er 8 uger, hvis der efter dette tidspunkt ikke er nogen vækst, rapporteres den som negativ.

QA

Følgende stammer kan bruges som kvalitetskontrol:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus Coccoc 320 Coccoc 320

Fremragende udvikling forventes for de første tre nævnte arter, for M. fortuitum bør væksten være god, mens der for M. bovis ikke forventes en lille eller ingen vækst. I mellemtiden skal andre arter end slægten Mycobacterium hæmmes fuldt ud.

Begrænsninger

Det forberedte medium skal beskyttes mod lys, langvarig eksponering for lys får mediet til at blive fra grønt til blåt, i dette tilfælde kan mediet ikke længere bruges. Dette skyldes, at malachitgrønt er lysfølsomt.

Mediet, da det indeholder æg, kan let forurenes, hvis det ikke håndteres aseptisk. Det kan opløses, hvis det forurenes med proteolytiske bakterier.

Dyrkning og håndtering af bakterier af slægten Mycobacterium kræver kvalificeret personale, der er opmærksom på de biosikkerhedsforanstaltninger, der skal følges for at undgå at blive forurenet eller forurenet andre.

HCl bør ikke anvendes i neutraliseringstrinnet på grund af dannelsen af ​​natriumchlorid, som kan være giftigt for Kochs bacillus.

Prøver skal opbevares nedkølet og beskyttet mod lys, mens de ikke behandles.

Reference

1. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Löwenstein-Jensen selektivt medium. Fås på: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen medium. Fås på: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen medium. Fås på: foodsafety.neogen.com.
4. "Löwenstein-Jensen medium." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 20. nov. 2018, 15:15 UTC. 24. april 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Biokemiske test til identifikation af bakterier af klinisk betydning. 3. udg. Redaktionel Panamericana. Buenos Aires. Argentina.