ORCEIN: FUNDAMENT OG FORBEREDELSE - KEMI - 2025

Den orceína er et naturligt farvet lilla, ekstraheres fra forskellige lav som Orchilla eller archill, fruticose lichen Rocella tinctoria og Lecanora Parella hovedsagelig. Rocella tinctoria findes på det afrikanske og det amerikanske kontinent, selvom det kan erstattes af andre arter, der findes i Europa.

Denne plet er blevet brugt i vid udstrækning i cytogenetiske undersøgelser siden oldtiden. I denne forstand blev orceinpræparatet, der inkluderer eddikesyre, introduceret af LaCourt i 1941, hvorfor det oprindeligt blev kaldt LaCourt-teknikken.

Kemisk struktur af orcein og orceinopløsning. Kilde: Wikipedia.org/ Oguenther på de.wikipedia (Dr. Guenther)

På grund af dens enkelhed og lave omkostninger er det ligeledes blevet brugt til fremstilling af lakmus (en plet ekstraheret fra lav) og i histologiske undersøgelser (farvning af celler og væv).

Flere undersøgelser har brugt denne farvning kombineret med andre kemikalier, såsom ammoniak picrocarminat og eddikesyre, til at plette elastiske fibre og kromosomer. På nuværende tidspunkt anvendes orcein fortsat til de cytogenetiske undersøgelser af dyr og planter.

For nylig har Silva et al. 2017 brugte denne plet med succes til at observere de forskellige ændringer, der forekommer i de elastiske fibre i tommelfingerskæret hos chilenske ældre voksne. Denne undersøgelse afslørede, hvordan fibrene i tommelfingeren ændrer sig med aldring.

I denne forstand blev de elastiske fibre observeret at have brun-sort i farve hos individer over 80 år; mens de i de yngste (fra 60 år) ses som rødbrune. Cytoplasmaet og andre cellestrukturer bliver gulgrønne.

Dette gjorde det muligt at bekræfte tilstedeværelsen og tilstanden af ​​de elastiske fibre med hensyn til deres placering, mængde og integritet. På den anden side er det også blevet indikeret, at orcein er til stor hjælp til at identificere aneurismer og diagnosticere arteritis blandt andre tilstande.

Basis

Orcein er en del af oxazingruppen af ​​farvestoffer, og farvningen er baseret på dens affinitet for DNA. Farvestoffet binder til den negative ladning af dette molekyle, repræsenteret af phosphatgruppen. Derfor er kromosomerne farvet lilla.

Resten af ​​cellens strukturer får imidlertid en anden farve. Specielt for elastiske fibre er de farvet rødbrune, cellekerner fra blå til mørk lilla, mens kollagen ikke pletter.

Af denne grund bruges orcein til at farve kromatin og differentiere køn i nogle fluer. Ligeledes kan kerner og nogle leverinklusioner produceret af hepatitis B-antigener farves.

Orcein-opløsninger har specifikke funktioner i farvning. Orcein A har funktionen at blødgøre cellemembranerne, forårsage deres død og lamme processen for deres opdeling. I mellemtiden er orcein B ansvarlig for at afslutte farvningen ved dens vedhæftning til kromosomerne.

Forberedelse

Aceto-orceinopløsning 1%

For at fremstille en 1% opløsning af aceto-orcein opløses 2 gram orcein i 45 ml iseddike, fortrinsvis varm, og 55 ml destilleret vand tilsættes ved stuetemperatur.

Derefter blandes det konstant for at homogenisere opløsningen for senere at lade den hvile, indtil den afkøles. Endelig opbevares det ved 4 ° C i mørke krukker. Dette præparat blev brugt af Flores 2012 til at observere modningsfaser af koococytter.

I dette tilfælde anbringes for eksempel aceto-orcein-opløsningen på det væv, der tidligere var fikseret i eddikesyre-ethanol i 24 timer. Denne farvningsproces udføres i 30 minutter, og vævet misfarves derefter.

Ligeledes kan det bruges til identifikation af organeller i multicellulære væv. I dette tilfælde farves en udstrygning af den bukkale slimhinde med et dråbe aceto-orcein-opløsning, dækglasset anbringes på objektglaset, og cellekernen med dens understrukturer kan øjeblikkeligt observeres.

Laktoproponisk opløsning orcein 1%

Derudover kan orcein fremstilles sammen med andre kemikalier, såsom mælkesyre og propionsyre. For at gøre dette opløses et gram orcein i en forblandet opløsning ved stuetemperatur på 23 ml mælkesyre og 23 ml propionsyre; fyldes op med 100 ml destilleret vand.

Med denne laktopropioniske orceinopløsning er det muligt at observere de forskellige faser af meiotisk opdeling af planteceller. I dette tilfælde anbringes den præfixerede og hydrolyserede prøve i 15 minutter i den lacto-propioniske orceinopløsning, og derefter spredes vævet på mikroskopglas.

I Duque 2016-undersøgelse af polygene kromosomer brugte han et præparat af 2 gram orcein fortyndet i eddikesyre og 85% mælkesyre, fortyndet med en 65% eddikesyreopløsning. Til sidst kiggede han på kromosomerne i spytkirtlerne i Drosophila melanogaster.

Orcein A og Orcein B

Det er vigtigt at bemærke, at afhængigt af prøven og hvad der skal evalueres, fremstilles den passende orceinopløsning. Således sættes for eksempel 1 N saltsyre til orcein A-opløsningen for at observere opdelende celler.

Mens orcein B-opløsningen opløses i 45% eddikesyre. Denne teknik er en forkortet farvningsmetode og bruges generelt som et supplement til farvning af kromosomale strukturer.

Endelige tanker

Siden århundreder tidligere kan lavarter som Lecanora, Parmelia og Umbilicaria findes i lande på det amerikanske kontinent, såsom Argentina, som er gode kilder til orcein. Også europæiske områder som De Kanariske Øer var på det tidspunkt store producenter af orchillaen.

Dette blev eksporteret til andre byer på dette samme kontinent, såsom Genoa og lande som England, mens Holland monopoliserede fremstilling af lakmus fra orkesten. Derfor blev denne lav senere reduceret, indtil den var ved at blive udryddet.

Dette førte til, at orchillaen blev erstattet af andre planter med farveegenskaber. Fremkomsten af ​​syntetiske farvestoffer bidrog imidlertid til afslutningen af ​​handelen med denne orceinkilde lav.

Dette var muligt takket være Cocq, der i 1812 beskrev syntesen af ​​orcein, da han vidste, at den blev syntetiseret af en phenolforbindelse kaldet orcinol. På trods af dette er naturlig orcein stadig den foretrukne i dag.

Dette kan skyldes, at orcinol er en meget stærk lugtende forbindelse, og hvis langvarige eksponering kan føre til sundhedsrisici, såsom tab af evnen til at opdage lugt. Disse skader på hypofysen kunne gå fra midlertidig til permanent, jo større er eksponeringen.

Referencer

1. Ortega L, García R, Morales C. «Anvendelse af laccase produceret af svampe til nedbrydning af mikrobiologiske farvestoffer (orcein og krystalviolet).» Unge i videnskab 2. 2015; 633-637. Fås på: jovenesenlaciencia.ugto.mx.
2. Barcat J. Orceína og elastiske fibre. Medicine (Buenos Aires) 2003; 63: 453-456. Fås på: Medicinabuenosaires.com.
3. Silva J, Rojas M, Araya C, Villagra F. Histologiske egenskaber ved den flyvende ansigtshud af tommelfingeren hos chilenske individer med falmende dactylogram. J. Morphol. 2017 35 (3): 1107-1113. Fås på: scielo.conicyt.
4. Orrillo M, Merideth B. "Kartoffel reproduktionsbiologi og cytogenetik." International Potato Center (CIP). Teknisk manual. Tilgængelig på: research.cip.cgiar.org/
5. Flores F. «Samling, kultur og in vitro modning af koococytter (bos taurus) i de bolivianske højland.". Det Nationale Universitet i Altiplano, Puno-Peru; 2012. Tilgængelig på: repositorio.unap.edu.pe.
6. Duque C. Polytenkromosomer: Et kig på fænomenet endoreduplikation. Nationaluniversitetet i Colombia, Medellín; 2016. Fås på: edu.
7. Camarena F. Cellular and Molecular Biology. Øv manual. Det autonome universitet i Baja Californien. 2017. Tilgængelig på: pez.ens.uabc.mx.
8. FAO / IAEA. 2018. Manual til differentiering af vilde og opdrættede Anastrepha ludens (Loew) fluer fra normal stamme (“bi-seksuel”) og genetisk kønnet stamme (Tapachula-7), bestrålet og ikke-bestrålet. Guillen Aguilar JC, López Muñoz L, López Villalobos EF og Soto García DN De Forenede Nationers Fødevare- og Landbrugsorganisation. Rom, Italien, 95 s.
9. Orcein. (2018, 30. november). Wikipedia, The Free Encyclopedia. Høringsdato: 03:38, 31. juli 2019 es.wikipedia.org.
10. Merck Millipore. (2018, 16. juli). Orcein-mikroskopi til Certistain-mikroskopi. Fås på: merckmillipore.com