DNA-SEKVENTERING: MAXAM-GILBERT, METODE OG EKSEMPLER - BIOLOGI - 2025

Den DNA-sekventering (deoxyribonukleinsyre) er en procedure i molekylærbiologiske laboratorier, der tillader at kende rækkefølgen af nukleotider i det genetiske materiale af interesse. Endvidere kan sekventeringen af ​​RNA (ribonukleinsyre) også beskrives.

Denne teknik har været uundværlig for udviklingen af ​​biologiske videnskaber. Det gælder også for andre videnområder - f.eks. Medicinsk diagnose og retsmedicinske undersøgelser.

Kilde: pixabay.com

Tidligere blev sekventeringen af ​​en DNA-streng betragtet som en langsom og dyr aktivitet, som muliggjorde identifikation af kun et par basepar i oligonukleotiderne.

I dag, med alle fremskridt inden for videnskab, er DNA-sekventering en rutinemæssig operation i mange laboratorier verden over takket være bidraget fra næsten 50 års forskning på dette område. Med hensyn til kædelængde kan op til millioner af basepar parificeres på meget kort tid.

For at gøre dette er der snesevis af teknikker udviklet, der varierer i pris og præcision. I denne artikel beskriver vi både klassiske og moderne teknikker, hver med sine fordele og ulemper.

Indtil nu tillader sekventeringsteknikker opnåelse af sekvensen af ​​komplette genomer, fra små prokaryoter og gær til det humane genom.

DNA-struktur

For at forstå de metoder og teknikker, der anvendes til DNA-sekventering, er det nødvendigt at kende visse nøgleaspekter af molekylets struktur og sammensætning.

DNA er en biomolekyle, der findes i alle levende ting, fra bakterier til store akvatiske dyr. Organeller - ligesom mitokondrier og kloroplaster - har et cirkulært DNA-molekyle inde i dem. Selv i nogle vira er det fundne genetiske materiale DNA.

Strukturelt er DNA en samling af nukleotider. Hver består af et kulhydrat, en nitrogenbase (A, T, C eller G) og en phosphatgruppe. Målet med DNA-sekventering er at afsløre rækkefølgen, i hvilken de fire nitrogenholdige baser findes i sekvensen.

Historie

I midten af ​​1950'erne beskrev forskerne Watson og Crick strukturen af ​​DNA ved hjælp af kristolografiske teknikker. Ingen af ​​disse forskere havde imidlertid været i stand til at finde en måde at afsløre sekvensen på.

Selv om der var visse forgængere, var den vigtigste begivenhed oprettelsen af ​​Sanger-metoden, i 1977. Frederick Sanger, far til metoden, var en britisk biokemiker, der vandt to nobelpriser for hans enorme bidrag til de biologiske videnskaber.

Denne teknik er også kendt i litteraturen som "kædeterminering" eller dideoxynukleotider. Principperne for denne teknik og dem, der blev udviklet på baggrund af dens forbedring og innovation, vil blive beskrevet nedenfor.

Sanger-metode

Udviklingen af ​​Sanger-metoden repræsenterede en afgørende begivenhed i molekylærbiologi. Det involverer de grundlæggende komponenter i DNA-replikationsprocessen, der normalt forekommer i cellen, men tilsætning af en speciel komponent: dideoxynukleotider.

Hovedkomponenter i reaktionen

- DNA-polymerase: DNA-polymerase-enzymet er et vigtigt element i processen. Dette molekyle deltager i replikationen af ​​DNA-strengen, og dets rolle er syntesen af ​​den nye streng, sammenkobling af triphosphatdeoxyribonukleotider med de komplementære.

Husk, at i DNA parerer thyminer (T) med adeniner (A) gennem to hydrogenbindinger, mens cytosin (C) gør det med guanin (G) gennem tre bindinger.

- Nukleotider: Sanger-sekventering involverer to typer nukleotider, de fire 2'-deoxynukleotider (forkortet dATP, dGTP, dCTP og dTTP) og de fire dideoxynukleotider (ddATP, ddGTP, ddCTP og ddTTP).

Selvom dideoxynukleotider ligner de monomerer, der normalt inkorporeres i DNA, mangler de en -OH-gruppe i deres struktur. Dette gør det umuligt at tilføje et nyt nukleotid til kæden.

Derfor, når et specielt nukleotid tilsættes - på en helt tilfældig måde - til kæden i dannelsen, er syntesen lammet. I slutningen af ​​reaktionen er der således kæder i forskellige størrelser, hver hvor reaktionen blev stoppet på et andet punkt.

Eksperimentelt forberedes fire test. Hver indeholder DNA ekstraheret fra den biologiske prøve af interesse, de normale nukleotider og en af ​​de fire specielle nukleotidtyper. Enten er de specielle nukleotider markeret med en type fluorescerende markør (se automatisk sekventering nedenfor).

Læsning af resultaterne

Det første trin er at adskille hver af de syntetiserede kæder i henhold til deres størrelse. Nogle vil være længere end andre, afhængigt af hvor de specielle baser blev inkorporeret.

Der er forskellige biokemiske teknikker, der tillader adskillelse af komponenterne i en blanding under anvendelse af størrelse som en diskriminerende egenskab. I Sangers metode adskilles de forskellige kæder ved elektroforese. I de mere sofistikerede varianter af teknikken bruges kapillærelektroforese.

Således rejser de længere tråde mindre end de kortere varianter. Dette system går derefter gennem en læser, der genkender markøren inkluderet i hvert dideoxynukleotid. På denne måde kan rækkefølgen af ​​sekvensen kendes.

Denne "første generation" teknik er i stand til at læse DNA-fragmenter, der ikke er større end 1 kilobase. På nuværende tidspunkt anvendes Sanger-metoden i forskellige laboratorier, generelt i dens moderne varianter. Derudover bruges det til at bekræfte de opnåede resultater med de mest komplekse teknikker - men mindre præcise.

Automatisk sekventering

Når sekvensering kræves i stor skala, accelereres processen gennem automatisering. Dette er en variation af Sanger-kædetermineringsmetoden, hvor primerne er mærket med fluorescerende produkter for at skelne dem.

Efterfølgende køres reaktionsproduktet i en elektroforese - alt sammen på en enkelt bane. Når hvert fragment forlader den endelige del af gelen, identificeres den hurtigt ved dens fluorescerende mærkning med en fejl omkring 1%.

De mest sofistikerede systemer har et system på op til 96 kapillarrør styret af en computer koblet til en robot. Det vil sige, 96 DNA-prøver kan testes samtidigt. Processen, der involverer elektroforese og analyse af resultaterne, er således fuldt automatiseret.

På en dag kan disse systemer sekvensere op til 550.000 baser. Under processen er menneskelig arbejdskraft unødvendig, det tager kun ca. 15 minutter at starte metoden.

Maxam-Gilbert sekventering

På samme tid som Sanger offentliggjorde sit arbejde, lykkedes det to forskere ved navn Allan Maxan og Walter Gilbert at udvikle en anden metode til at få DNA-sekvensen. Metoden fik popularitet på det tidspunkt, men blev senere fortrængt af forbedringen af ​​Sangers metode.

I modsætning til Sanger-metoden involverer ikke Maxan og Gilbert-sekventering (eller kemisk sekventering, som det også er kendt) hybridiseringsreaktioner. Metodikken består af mærkning med reaktive stoffer i den ene ende efterfulgt af en oprensningsproces.

Et af de negative aspekter ved denne teknik ligger i dens enorme kompleksitet og i brugen af ​​kemikalier, der er farlige for brugeren. Kemiske brud induceres ved anvendelse af DMS, myresyre, hydrazin og hydrazin med salte.

Behandle

Protokollen begynder med markeringen i 5'-enden af ​​strengen med den fosforholdige markør 32, derefter sker der en kemisk modifikation af den nitrogenholdige base, og den adskilles. Endelig forekommer spaltningen af ​​det abasiske område.

Først forkorter du den streng, du vil sekvensere, til mindre segmenter. Dette trin udføres med restriktionsenzymer, hvilket resulterer i fremspringende ender.

Derefter udføres reaktionen med en alkalisk phosphatase, hvis formål er at eliminere phosphatgruppen. Således kan en polynukleotidkinase anvendes til at udføre mærkningen.

Kæden denatureres (de to tråde er åbne). Derefter påføres kemikalierne. Disse spaltningsreaktioner udføres på en kontrolleret måde, og det vides, hvilke typer bindinger hver anvendt kemikalie bryder.

Læsning af resultaterne

Som i Sanger-metoden involverer aflæsning af resultaterne adskillelse efter størrelse af kæderne opnået i et elektroforesesystem. Systemer sammensat af polyacrylamid gør det muligt at opnå en meget passende opløsning til læsning af gelen.

Massesekvensering

Den massive sekventering omfatter en række nye metoder, forkortet som NGS, fra den engelske “Next Generation Sequencing”.

Metoderne klassificeret som NGS kræver et tidligere DNA-amplifikationstrin (de fungerer ikke med et enkelt molekyle). Desuden varierer de anvendte platforme meget. Principperne for de mest populære metoder vil blive beskrevet nedenfor:

pyrosekventering

Det involverer overvågning af frigivelsen af ​​et pyrophosphat, der opstår, hver gang et nyt nukleotid tilsættes til DNA-strengen. Et system af enzymer er koblet, så emissionen af ​​lys (som kan detekteres af et kamera) forekommer hver gang et nyt nukleotid inkorporeres.

Processen begynder med den separate inkubation af hver nitrogenbase for at kontrollere, om der er lysemission eller ej. Pyrosequencing kan læse lange tråde, men den fundne fejlrate er høj.

Syntesesekvensering

Dette involverer inkorporering af mærkede nukleotider. Disse fluorescerende komponenter tilsættes, vaskes, og det inkorporerede nukleotid bemærkes. Derefter fjernes nukleotidmærket, og syntesen af ​​strengen kan fortsætte. I det næste trin vil et mærket nukleotid også blive inkorporeret, og de førnævnte trin gentages.

En ulempe ved denne teknik opstår, når de fluorescerende markører ikke fjernes fuldstændigt. Disse emissioner skaber baggrundsfejl, hvilket resulterer i betydelige fejl.

Ligation sekventering

Denne teknik varierer fra de andre, da den ikke bruger DNA-polymerase. I stedet er nøglenzymet til denne metode ligase. Her anvendes fluorescerende mærkede DNA-fragmenter, det er forbundet med enzymet, og det detekteres.

Det største problem med denne teknik er den korte fragmentlengde, den er i stand til at behandle.

Ion Torrent Sequencing

Denne teknik er baseret på måling af H ⁺ -ionen, der frigøres hver gang et nyt nukleotid inkorporeres. Princippet ligner ganske pyrosekventering, men meget billigere.

eksempler

Sekventering af det humane genom

Sekventering af det menneskelige genom har været en af ​​de mest lovende udfordringer inden for biologi, ligesom det er en af ​​de mest anerkendte rivaliteter i videnskabshistorien. For forskerne, der var involveret i projektet, blev sekvensering af genomet faktisk en konkurrence.

I 1990 startede han det, der blev kaldt "det menneskelige genom-projekt", ledet af den berømte videnskabsmand, nobelprisvinderen, James Watson. Efter et år, i 1991, påtager Venter udfordringen med at "slå" Watson og sekventere genomet foran sig. I 1992 trak Watson sig imidlertid tilbage, og kommandoen blev taget af en anden forsker.

I 1995 annoncerede Venter sin succes med den komplette sekventering af et bakteriegenom ved tilfældig sekventeringsmetode. Tilsvarende annoncerede modstanderholdet et år senere sekventering af gærgenomet.

I 2000 blev graden afsluttet. Begge virksomheder offentliggjorde deres foreløbige hel genomresultater i to af videnskabens mest prestigefyldte tidsskrifter: Natur og videnskab.

Imidlertid fortsatte forskere med at forbedre forslagene, og i 2006 blev sekvenserne af visse menneskelige kromosomer afsluttet.

Betydning og applikationer

At kende rækkefølgen af ​​nukleotiderne i et så vigtigt molekyle som DNA er værdifuldt for biologer og beslægtede fagfolk. Denne kæde af polynukleotider indeholder al den information, der er nødvendig for udvikling og vedligeholdelse af alle former for liv.

Af disse grunde er viden om denne sekvens væsentlig for biologisk forskning. Grundlæggende gør sekvensbestemmelse det muligt at måle en af ​​de vigtigste egenskaber ved biologiske systemer og etablere forskelle mellem dem.

Sekventering er vidt brugt af taksonomer og systematikere, da visse DNA-sekvenser gør det muligt at etablere kriterier for at konkludere, om to organismer hører til den samme art eller ikke, ud over at være i stand til at foreslå hypoteser om de fylogenetiske forhold mellem dem.

Derudover har DNA-sekventering anvendelser inden for medicin og diagnostik. For eksempel er der billige og tilgængelige systemer, der gennem sekventering gør det muligt at vurdere tendensen til at udvikle visse sygdomme (såsom kræft) ved hjælp af såkaldte single nucleotide polymorfismer (SNP'er).

Undersøgelser af den kriminelle og retsmedicinske type er også beriget med sekventeringsteknikker, som kan bruges som pålidelig bevis for deltagelse af en bestemt person i en forbrydelse.

Referencer

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Sekvensen af ​​sekventer: historien om sekventering af DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Den næste generations sekventeringsrevolution og dens indflydelse på genomik. Cell, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Videnskabelige rivaliteter. Fra Galileo til det menneskelige genom-projekt. Redaktionel Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). DNA-sekventering med kædeterminerende inhibitorer. Forløb fra det nationale videnskabsakademi, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Næste generations sekventering transformerer nutidens biologi. Naturmetoder, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (red.). (2014). Næste generations sekvensering. Caister Academic Press.