VOGES-PROSKAUER TEST: FUNDAMENT, KLARGØRING OG ANVENDELSE - BIOLOGI - 2025

Den Voges-Proskauer test er en biokemisk test, der anvendes til hjælp ved identifikation af bakterier tilhørende Enterobacteriaceae-familien. Det er især nyttigt til at differentiere stammer af Escherichia coli fra blandt Klebsiella og Enterobacter.

Testen udføres i et flydende kulturmedium kaldet Methyl Red - Voges Proskauer, bedre kendt af forkortelsen RM / VP. Dette medium er sammensat af bufret polypepton, glucose, dipotassiumphosphat og destilleret vand.

Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) kommercielt medium / VP-test er henholdsvis positiv og negativ. Kilde: Foto taget af forfatteren MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, fra Wikimedia Commons

Det nuværende RM / VP-medium er en modifikation af Clark og Lubs-mediet, som oprindeligt indeholdt en lavere koncentration af peptoner og glukose. Således blev mindre af den hydrogenion, der kræves til den positive Voges-Proskauer-reaktion, produceret.

Testen er baseret på mikroorganismens evne til at anvende glukose gennem butylenglykolruten og danne et neutralt slutprodukt kaldet acetoin i nærvær af ilt og en alkalisk pH.

I RM / VP-mediet kan den methylrøde test ud over at være i stand til at afsløre Voges-Proskauer-testen også afsløres.

Basis

Voges-Proskauer testgrundlag

Pluripeptonerne, der er til stede i mediet, tilvejebringer de væsentlige ernæringskrav til bakterievækst. På sin side er glukose hovedforbindelsen. Mange bakterier har evnen til at metabolisere glukose og danne pyruvinsyre.

Pyruvinsyre er et midtpunkt i glukosemetabolismen, og derfra kan hver mikroorganisme tage forskellige veje. Nogle vil danne blandede syrer, såsom mælkesyre, eddikesyre, myresyre og ravsyre, og andre vil danne neutrale produkter som 2,3-butandiol.

Voges-Proskauer-testen afslører mikroorganismens evne til at danne acetylmethylcarbinol (acetoin), et mellemprodukt af 2,3-butandiol under aerobe forhold.

Acetoin reduceres og danner 2,3-butandiol, men denne reaktion er reversibel, så hvis 2,3-butandiol oxideres, dannes acetoin. Derfor er ilt meget vigtigt.

Dipotassiumphosphat er den puffer, der buffrer blandingen ved pH 6,9 ± 0,2.

Bevis afsløring og fortolkningsgrundlag

For at demonstrere reaktionen skal en udvikling udføres ved hjælp af to reagenser (Barrit-reagenser), kendt som Voges A og Voges B.

Voges A er en 5% opløsning af a-naphthol, og Voges B er et 40% kaliumhydroxidpræparat. Hvis kaliumhydroxid ikke er tilgængeligt, kan det erstattes af 40% natriumhydroxid.

Α-Naphthol er en katalysator, der øger intensiteten af ​​reaktionsfarven, hvilket gør testen mere følsom. Α-naphthol skal altid tilføjes først, rystes røret, så mediet kommer i kontakt med iltet. På denne måde oxideres den tilstedeværende acetoin til diacetyl, og 2,3-butandiol oxideres til dannelse af acetoin, hvorefter den overføres til diacetyl.

Sådan binder α-naphthol sig til diacetyl, som igen er forbundet med guanidinkernen, der er til stede i aminosyren arginin, hvor sidstnævnte kommer fra pluripeptoner.

På sin side er kalium eller natriumhydroxid ansvarlig for at absorbere CO ₂ og reagere med peptoner. Denne reaktion medfører dannelse af en laksefarvet farve, der er godt synlig efter rystning af røret meget godt.

Korrekte mængder diacetyl, pepton og α-naphthol skal blandes for, at farve øjeblikkeligt kan forekomme. Hvis dette ikke sker, får røret lov til at hvile i 15 minutter, før det tolkes.

Testen er normalt positiv efter 2 til 5 minutter, når en svag lyserød farve kan ses. Hvis det lader stå i 30 minutter til 1 time, er farveintensiteten maksimal (intens rød).

En negativ test vises, når buljongen bliver gul. Efter 1 time, hvis testen er negativ, kan der dannes en kobberfarve som et resultat af reaktionen af ​​kaliumhydroxid på a-naphthol.

Forberedelse

Medium MR / VP

Vej 17 g af det dehydrerede kulturmedium og opløst i en liter destilleret vand. Lad stå i 5 minutter. Varm op til kogning for at opløses helt. Server 3 til 4 ml i rør, og steriliser i autoklave ved 121 ° C i 15 minutter.

Det dehydratiserede dyrkningsmedium er beige i farve, og det tilberedte medium er let ravfarvet.

Mediets endelige pH er 6,9 ± 0,2.

Voges En reagens

Afvej 5 g a-naphthol og opløs i 50 ml ethylalkohol (absolut). Fortsæt derefter med tilsætning af ethylalkohol, indtil den når 100 ml.

Voges B-reagens

Afvej 40 g kaliumhydroxid og opløs i 50 ml destilleret vand i et bægerglas. Glasset skal anbringes i et koldt vandbad for at kontrollere temperaturen, for når præparatet er opløst, stiger temperaturen kraftigt.

Efter opløsningen er kold, overføres den til en volumetrisk kolbe og fyldes op til 100 ml med destilleret vand.

Voges-Proskauer testprocedure

For at udføre Voges-Proskauer-testen inokuleres en RM / VP-bouillon med den mikroorganisme, der undersøges, fra en ren kultur i 18 til 24 timer.

Inokulatet bør ikke være meget tæt. Det inkuberes ved 35-37 ° C i 24 til 48 timer, skønt inkubation i flere dage undertiden er nødvendig. Cowan og Steel er af den opfattelse, at 5 dage er den minimale inkubationstid, der er nødvendig for at påvise alle positive Voges-Proskauer (VP) arter af Enterobacteriaceae-familien.

Testudvikling

Adskil en 1 ml portion i et rør og udvikl som følger: Anbring 12 dråber (0,6 ml) Voges A reagens og 4 dråber (0,2 ml) Voges B. Bland til luftning og lad bundfælde i 5 - 10 minutter før tolkning. Hvis testen stadig er negativ, skal du lade den sidde og observere røret efter 30 minutter til 1 time.

Udseendet af en lyserød-rød farve indikerer, at Voges-Proskauer-reaktionen er positiv. Hvis mediet forbliver gult, er reaktionen negativ.

Det er vigtigt at tilføje udviklere i den angivne rækkefølge og mængde for at undgå falske negativer.

Brug

Voges-Proskauer-testen er nyttig til at skelne mellem stammer af E. coli, der er VP-negative, af slægterne Klebsiella, Enterobacter, Serratia, blandt andre, der er VP-positive.

Kilde: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.

QA

Kontrolstammer, inklusive Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium og Enterobacter cloacae ATCC 13047, kan anvendes til at teste kvaliteten af ​​det forberedte medium.

De forventede resultater er positive Voges-Proskauer-reaktioner kun for K. pneumoniae og E. cloacae. Resten giver negative reaktioner.

Referencer

1. Britannia Laboratories. MR-VP Medium. 2015. Tilgængelig på: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Tilgængelig:
3. Mac Faddin J. (2003). Biokemiske test til identifikation af bakterier af klinisk betydning. 3. udg. Redaktionel Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.