SPORFARVNING: BEGRUNDELSE, TEKNIKKER OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den Spore farvning er den metode, der anvendes til at farve modstanden strukturer, som danner nogle bakteriel slægter når i ugunstige forhold; Disse strukturer svarer til en form for overlevelse.

Der er mange slægter, der danner sporer; de vigtigste er dog Bacillus og Clostridium. Disse slægter betragtes som mere relevante, fordi de har patogene arter for mennesker.

Sporfarvning efter Shaeffer - Fulton eller Wirtz-Conklin metoden. Og tambe (original uploader), fra Wikimedia Commons

Hver bacillus kan give anledning til en spore. På tidspunktet for farvning af præparatet kan sporen findes inden i bacillus (endospore) eller uden for den (exospore). Med konventionelle farvningsteknikker til bakterier - såsom Gram-farven - forbliver sporerne farveløse.

I øjeblikket er der flere farvningsmetoder, der er i stand til at trænge ind i den tykke struktur af sporen for at farve den. Disse metoder er meget forskellige; Disse inkluderer Dorner-teknikken, Möeller-pletten og Shaeffer - Fulton-metodikken, også kendt som Wirtz-Conklin.

Af alle de nævnte teknikker er Shaeffer-Fulton-metodikken den mest anvendte i rutinelaboratorier. Det er opkaldt efter to mikrobiologer, der skabte farven i 1930: Alicia Shaeffer og MacDonald Fulton. Teknikken kaldes dog undertiden Wirtz-Conklin efter to bakteriologer fra 1900-tallet.

Basis

Sporer pletter ikke med konventionelle pletter, fordi de har en meget tyk væg. Sporernes komplekse sammensætning forhindrer indtrængen af ​​de fleste farvestoffer.

Hvis sporen studeres fra ydersiden til indersiden, observeres følgende lag: først er der exosporium, som er det tyndeste og ydre lag dannet af glycoproteiner.

Dernæst kommer neglebåndet, der giver modstand mod høje temperaturer, efterfulgt af cortex sammensat af peptidoglycan. Senere er væggen på basen, der beskytter protoplasten.

Sporen er en dehydreret struktur, der indeholder 15% calcium og dipicolinsyre. Derfor er de fleste sporefarvningsteknikker afhængige af anvendelse af varme, så farvestoffet kan trænge ind i den tykke struktur.

Når sporen er farvet, kan den ikke fjerne farvestoffet. I Shaeffer - Fulton-teknikken trænger malachitgrønt ind i vegetative celler, og når varme påføres, trænger det ind i endosporen såvel som i eksosporerne.

Ved vask med vand fjernes farvestoffet fra den vegetative celle. Dette opstår, fordi det malachitgrønne farvestof er let basisk, så det binder svagt til den vegetative celle.

I stedet kan den ikke komme ud af sporen, og til sidst tælles bacillusen med safranin. Dette fundament er gyldigt for resten af ​​teknikkerne, hvor noget lignende sker.

Spore-farvningsteknikker

For at udføre sporfarvningen skal der opnås en ren kultur af den mistænkelige stamme, der skal undersøges.

Kulturen udsættes for ekstreme temperaturer i 24 timer for at stimulere mikroorganismen til at sporulere. Til dette kan kulturen anbringes i en ovn ved 44 ° C eller i køleskab (8 ° C) i 24 eller 48 timer.

Hvis man lader for længe ved de nævnte temperaturer, observeres kun exosporer, da alle endosporer allerede er forladt bacillus.

Ved afslutningen af ​​tiden skal et par dråber steril fysiologisk opløsning placeres på et rent objektglas. Derefter tages en lille del af kulturen, og der laves en fin spredning.

Derefter lodes det tørre, fikseres i varmen og farves med en af ​​nedenstående teknikker:

Dorner teknik

1- Forbered i et reagensglas en koncentreret suspension af den sporulerede mikroorganisme i destilleret vand, og tilsæt et lige stort volumen filtreret Kinyoun carbol fuchsin.

2- Placer røret i et bad med kogende vand i mellem 5 og 10 minutter.

3- På et rent objektglas blandes en dråbe af den forrige suspension med et dråbe 10% vandig nigrosinopløsning, koges og filtreres.

4- Spred og tør hurtigt med skånsom varme.

5- Undersøg med et 100X mål (nedsænkning).

Sporer farves røde, og bakteriecellerne ser næsten farveløs ud mod en mørkegrå baggrund.

Ændret Dorner-teknik

1- En suspension af den sporulerede mikroorganisme spredes på et objektglas og fikseres i varmen.

2- Prøven dækkes med en filterpapirstrimmel, hvortil der sættes carbol fuchsin. Farvestoffet opvarmes i 5 til 7 minutter med flammen af ​​Bunsen-brænderen, indtil udviklingen af ​​dampe dannes. Derefter fjernes papiret.

3 - Præparatet vaskes med vand og tørres derefter med absorberende papir.

4- Dæk udstrygningen med en tynd film på 10% nigrosin ved hjælp af et andet objektglas til at sprede nigrosin eller en nål.

Farvningen taget af sporer og bakterier er den samme som beskrevet i den kendte teknik.

Shaeffer - Fulton eller Wirtz-Conklin teknik

1- Lav en fin udstrygning med en suspension af den sporulerede mikroorganisme på et objektglas og fastgør til varme.

2- Dæk objektglasset med 5% malachitgrøn vandig opløsning (du kan placere et filterpapir på objektglaset).

3 - Opvarm over Bunsen-brænderens flamme for at forårsage frigørelse af dampe og fjerne flammen. Gentag handlingen i 6 til 10 minutter. Hvis den malachitgrønne opløsning fordamper for meget under proceduren, kan der tilføjes mere.

4- Fjern filterpapiret (hvis monteret) og vask med vand.

5- Dæk objektglasset med 0,5% vandigt safranin i 30 sekunder (nogle varianter af teknikken bruger 0,1% vandigt safranin og lad det stå i 3 minutter).

Med denne teknik forekommer sporerne grønne og bacillerne røde.

Det har den ulempe, at endosporerne fra unge kulturer ikke pletter godt, da de forekommer ekstremt klare eller farveløse. For at undgå dette anbefales det at bruge kulturer på 48 timers inkubation.

Möeller teknik

1- Dæk udstrygningen med chloroform i 2 minutter.

2- Bortskaf chloroformen.

3 - Dæk med 5% kromsyre i 5 minutter.

4- Vask med destilleret vand

5- Arket er dækket med carbol fuchsin-fenicada og udsættes for flammen af ​​Bunsen-brænderen indtil udledning af dampe; derefter fjernes det fra flammen i et øjeblik. Handlingen gentages, indtil 10 minutter er afsluttet.

6- Vask med vand.

7- Brug syrnet ethanol (saltsyre) til misfarvning. Det er tilbage i 20 eller 30 sekunder.

8- Vask med destilleret vand.

9- Kontrastiner ved at dække arket med methylenblåt i 5 minutter.

10- Vask med destilleret vand.

11- Lad det tørre, og prøven føres til mikroskopet.

Sporerne vises røde og bacillerne blå. Det er vigtigt ikke at indånde damperne, da de er giftige og på lang sigt kan være kræftfremkaldende.

Ændret Möeller-teknik uden varme

I 2007 skabte Hayama og hans samarbejdspartnere en ændring af Möeller-teknikken. De eliminerede trinnet med opvarmning af farvestoffet og erstattede det ved tilsætning af 2 dråber af det overfladeaktive middel Tergitol 7 for hver 10 ml carbol-fuchsin-carbol-opløsning. De samme resultater blev opnået.

Applikationer

Farvning af sporer giver meget værdifuld og nyttig information til identifikation af patogenet, da dets tilstedeværelse, dens form, placering inden i bacillus og evnen til at deformere den vegetative celle eller ej, er data, der kan vejlede arten involveret i en bestemt genre.

I denne sammenhæng er det værd at sige, at sporerne kan være runde eller ovale, at de kan være placeret i midten eller også i en paracentral, subminal eller terminalstilling.

Diagram over form og placering af endosporer og exosporer

eksempler

- Clostridium difficile danner en oval spore i en terminalposition, der deformerer bacillus.

- Sporen af ​​Clostridium tertium er oval, deformerer ikke bacillus og er placeret på terminalniveau.

- Endosporen af ​​Clostridium tetani er terminal og deformerer bacillus, hvilket giver udseende som en trommestikker.

- Sporerne af Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy og C. septicum er runde eller ovale subterminale og deformerer bacillus.

- Endosporen af ​​Clostridium sordelli er placeret i den centrale position med en let deformation.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. (5. udgave). Argentina, Redaktion Panamericana SA

Referencer

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Forslag til en forenklet teknik til farvning af bakteriesporer uden anvendelse af varme - vellykket ændring af Moellers metode. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Wikipedia-bidragydere. Moeller-plet. Wikipedia, The Free Encyclopedia. 3. november 2018, 03:28 UTC. Tilgængelig på: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratorievejledning til mikrobiologiske teknikker. Institut for Grundlæggende Videnskaber Akademi for Mikrobiologi. National Polytechnic Institute.
4. "Endospore." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 25 feb. 2018, 10:20 UTC. 10. januar 2019, 02:42: da.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J og samarbejdspartnere. (2006). Arbejdspersonale i det autonome samfund Extremadura. Specifik dagsorden Bind IV. Redaktionel MAD. Sevilla-Spanien, s. 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). Specialistlaborator, Galician Health Service (SERGAS). Specifikt emne dagsorden bind 2. Redaktionel MAD. Sevilla-Spanien, s. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. (5. udgave). Argentina, Redaktion Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Argentina. Redaktionel Panamericana SA