GIEMSA-PLET: BEGRUNDELSE, MATERIALER, TEKNIK OG ANVENDELSER - BIOLOGI

Den Giemsa farve er en type af farve kliniske prøver, baseret på blandingen af sure og basiske farvestoffer. Dens oprettelse blev inspireret af det arbejde, der blev udført af Romanowsky, hvor Gustav Giemsa, en kemiker og bakteriolog, oprindeligt fra Tyskland, perfektionerede det ved at tilføje glycerol til at stabilisere forbindelserne.

Ændringerne genereret til den originale Romanowsky-teknik gjorde det muligt at forbedre de mikroskopiske observationer betydeligt, derfor blev teknikken døbt med Giemsa-pletten.

Forskellige prøver farvet med Giemsa-farve. A. Trypanosoma evansi i perifert blod. B. Normale blodlegemer. C. Borrelia theileri i perifert blod. D. Burkitt's lymfom.

Fordi det er en simpel teknik at udføre, meget funktionel og økonomisk, er den i øjeblikket meget anvendt i det kliniske laboratorium til hæmatologisk udstrygning, knoglemarvsprøver og vævsektioner.

Giemsa-farvningsteknikken er meget nyttig til cytologiske undersøgelser, da den muliggør observation af specifikke cellestrukturer. Denne teknik farver cytoplasmer, kerner, nucleoli, vakuoler og granulater af celler og er i stand til at skelne jævne fine spor af kromatin.

Derudover kan der påvises signifikante ændringer i størrelse, form eller farve på kernen, hvor det er muligt at visualisere tabet af forholdet mellem nucleus-cytoplasma.

På den anden side gør det det muligt at identificere umodne celler i knoglemarv og perifert blod, hvilket er vigtigt for diagnosen alvorlige sygdomme, såsom leukæmi. Det er også muligt at påvise hæmoparasitter, ekstra og intracellulære bakterier, svampe, blandt andre.

I cytogenetik bruges det vidt, da det er muligt at undersøge mitosen i celler.

Grundlag for Giemsa-farvning

Romanowsky-farvestoffer er baseret på anvendelse af en kontrast mellem sure og basiske farvestoffer for at opnå farvning af henholdsvis basiske og sure strukturer. Som det kan ses, er der en affinitet af syrefarvestoffer til at plette basale strukturer og vice versa.

Det anvendte basiske farvestof er methylenblåt og dets oxiderede derivater (Azure A og Azure B), mens syrefarvestoffet er eosin.

Cellernes syrestrukturer er nukleinsyrerne, granulaterne af de segmenterede basofiler, blandt andre, derfor vil de blive farvet med methylenblå.

I denne samme forstand er de grundlæggende strukturer af celler hæmoglobin og nogle granulater, såsom dem indeholdt i segmenterede eosinofiler, blandt andre; disse vil være farvet med eosin.

På den anden side, på grund af det faktum, at methylenblå og azurblå er karakteriseret ved at være metachromatiske farvestoffer, kan de tilvejebringe en variabel farvetone til de forskellige strukturer i henhold til belastningen af polyanioner, de besidder.

Det er sådan, at den strategiske kombination af basiske og sure farvestoffer formår at udvikle et bredt spektrum af farver i henhold til de biokemiske egenskaber ved hver struktur ved at gå gennem lyseblå, mørkeblå, syrin og lilla farver i tilfælde af syrestrukturer.

Mens farven, der leveres af eosin, er mere stabil, genereres der farver mellem rødlig-orange og laks.

materialer

Materialer til forberedelse af stamopløsningen

Fremstilling af stamopløsningen kræver vejning af 600 mg pulveriseret Giemsa-farvning, måling af 500 cm3 acetone-fri methylalkohol og 50 cm3 neutral glycerin.

Sådan forberedes lageropløsningen

Læg det tunge Giemsa-pulver i en morter. Hvis der er klumper, skal de sprøjtes. Derefter tilsættes en mærkbar mængde af det målte glycerin og blandes meget godt. Den opnåede blanding hældes i en meget ren gul flaske.

Resten af glycerinet anbringes i morteren. Bland igen for at rengøre resten af farvestoffet, der har klæbet fast på murens vægge, og hæld i den samme krukke.

Flasken lukkes og anbringes i et vandbad ved 55 ° C i 2 timer. Mens det er i et vandbad, ryst forsigtigt blandingen hver halve time.

Derefter får blandingen lov til at afkøle for at placere alkoholen. Tidligere anbringes en del af den målte alkohol i mørtlen for at afslutte vask af det resterende farvestof, og derefter sættes det til blandingen sammen med resten af alkoholen.

Dette præparat skal lade modne i mindst 2 uger. Den anvendte del af stamopløsningen skal filtreres.

For at undgå kontaminering af præparatet anbefales det at overføre den del, der skal være i konstant brug, til en lille rav flaske med en dråber. Påfyld hver gang reagenset løber tør.

Materialer til fremstilling af bufferopløsningen

På den anden side fremstilles en bufferopløsning ved pH 7,2 som følger:

6,77 g natriumphosphat (vandfrit) (NaHPO ₄), 2,59 g kaliumdihydrogenphosphat (KH ₂ PO ₄ er) og destilleret vand vejes op til 1000 cc.

Endelig forberedelse af farvestoffet

Til fremstilling af den endelige farvningsopløsning måles 2 ml af den filtrerede stamopløsning og blandes med 6 ml af bufferopløsningen. Rør blandingen.

En relevant kendsgerning, der skal tages i betragtning, er, at farveforberedelsesteknikkerne kan ændre sig afhængigt af det kommercielle firma.

Yderligere materialer, der er nødvendige for at udføre farvelægningen

Bortset fra de beskrevne materialer, skal du have farvebroer, t-shirts med vand eller buffer til vask, objektglass eller dæksler til genstande, et stopur til kontrol af farvetider og blottingpapir eller noget materiale, der kan bruges til at tørre (gasbind eller bomuld).

Teknik

Farvningsproces

1) Inden farvning skal prøvesprøjtningen være klar på et rent objektglas.

Prøverne kan være blod, knoglemarv, histologiske vævsektioner eller cervico-vaginale prøver. Det anbefales, at opslagene skal være tynde og have en eller to timers tørring inden farvning.

2) På en farvelæg skal du placere alle lagene, der skal farves. Du arbejder altid i samme rækkefølge, og hvert ark er godt identificeret.

3) Læg et par dråber 100% methylalkohol (methanol) på udstrygningen og lad den virke i 3 til 5 minutter for at fikse og dehydrere prøven.

4) Kasser metanol, der er til stede på arket, og lad det lufttørre.

5) Når den er tørt, anbring den endelige farvningsopløsning med en dropper, indtil hele arket er dækket. Lad det handle i 15 minutter. Nogle forfattere anbefaler op til 25 min. Det afhænger af forretningshuset.

6) Tøm pletten og vask udstrygningen med destilleret vand eller med en 7,2 bufferopløsning.

7) Lad pladerne tørre i friluft på et blottingpapir, lodret arrangeret ved hjælp af en støtte.

8) Rengør bagsiden af objektglaset med en alkoholpind eller vatpind for at fjerne spor af pletter.

Hjælpeprogrammer

Giemsa-farvningsteknikken bruges inden for forskellige områder, blandt dem: hæmatologi, mykologi, bakteriologi, parasitologi, cytologi og cytogenetik.

Hæmatologi

Det er den hyppigste anvendelse, der gives til denne plet. Med det kan hver og en af cellerne, der findes i knoglemarv eller perifere blodprøver, identificeres. Samt at estimere antallet af hver serie, være i stand til at påvise leukocytose eller leukopeni, thrombocytopeni osv.

Fordi det er følsomt til identifikation af umodne celler, er det relevant ved diagnosen akutte eller kroniske leukæmier. Det er også muligt at stille diagnosen anæmi, f.eks. Seglcelleanæmi, seglcelle, blandt andre.

mykologi

I dette område er det almindeligt at bruge det til at søge efter Histoplasma capsulatum (intracellulær dimorf svamp) i vævsprøver.

bakteriologi

Ved hæmatologisk udstrygning farvet med Giemsa er det muligt at påvise Borrelias sp hos patienter, der har sygdommen kaldet tilbagevendende feber. Spirocheter er rigelige blandt erytrocytter i prøver, der er taget på toppen af feberen.

Det er også muligt at visualisere intracellulære bakterier såsom Rickettsia sp og Chlamydia trachomatis i inficerede celler.

parasitologi

På området parasitologi har Giemsa-farvning gjort det muligt at diagnosticere parasitiske sygdomme som malaria, Chagas sygdom og leishmaniasis.

I de to første ses parasitterne henholdsvis Plasmodium sp og Trypanosoma cruzi i perifert blod fra inficerede patienter, de kan findes i forskellige stadier afhængigt af den fase, hvor sygdommen befinder sig.

For at forbedre søgen efter parasitter i blod anbefales det at bruge Giemsa-pletten blandet med May-Grünwald-pletten.

Ligeledes kan kutan leishmaniasis diagnosticeres ved at evaluere Giemsa-farvede hudbiopsiprøver, hvor parasitten findes.

cytologi

Giemsa-farvning bruges også til den cytologiske undersøgelse af endocervikale prøver, skønt det ikke er den mest anvendte teknik til dette formål.

Men i tilfælde af mangel på ressourcer kan det bruges med en lignende funktionalitet som den, der tilbydes af Papanicolaou-teknikken og til en lavere pris. Det kræver dog ekspertise fra eksaminatorens side.

cytogenetik

Et relevant træk ved Giemsa-farvning er dens evne til at binde stærkt til adenin- og thyminrige regioner af DNA. Dette gør det muligt at visualisere DNA under cellemitose i forskellige kondensationstilstande.

Disse undersøgelser er nødvendige for at detektere kromatiske afvigelser, såsom duplikationer, deletioner eller translokationer af de forskellige regioner i kromosomerne.

Forskning, der viser effektiviteten af Giemsa-farvning

Cannova et al (2016) sammenlignede 3 farvningsteknikker til diagnose af kutan leishmaniasis.

Til dette brugte de prøver opnået fra et forsøgsdyr (Mesocrisetus auratus) eksperimentelt inokuleret med Leishmanias.

Forfatterne demonstrerede, at Giemsa-pletten var bedre end Pap-mart®- og Gaffney-pletten. Derfor betragtede de Giemsa-pletten som ideel til diagnosticering af kutan leishmaniasis.

De fremragende resultater opnået af forfatterne skyldes det faktum, at kombinationen af farvestoffer, der udgør Giemsa-blandingen, giver de nødvendige betingelser for at skabe en gunstig kontrast, hvilket gør det muligt at skelne mellem strukturer i amastigoter, både intracellulært og ekstracellulært.

De andre teknikker (Pap-mart® og Gaffney) gjorde det også, men på en svagere måde og derfor vanskeligere at visualisere. Derfor anbefales Giemsa-pletten til den parasitologiske diagnose af leishmaniasis.

Ligeledes vurderede en undersøgelse af Ramírez et al (1994) gyldigheden af Giemsa og Lendrum-pletter i konjunktival udstødning til identifikation af Chlamydia trachomatis.

Forfatterne bestemte, at Giemsa og Ledrum-pletter har samme specificitet, men Giemsa blev fundet at være mere følsom.

Dette forklarer, hvorfor Giemsa-plet i øjeblikket er den mest anvendte til diagnose af klamydiale infektioner, især hvis der er få ressourcer.

Kilde: PanReac Applichem ITW-reagenser. Giemsa-plet. Version 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanien.

Anbefalinger til god farvning

Tørringen af pladerne bør ikke fremskyndes. Der skal forventes en rimelig mængde tid til at tørre den i det fri. Cirka 2 timer.

Farve straks efter 2 timer for at få de bedste resultater.

For at udstrygningen kan fikses og pletteres bedre, skal prøven fordeles på objektglaset på en sådan måde, at der forbliver et tyndt og ensartet lag.

Den foretrukne blodprøve er kapillær, da udstrygningen fremstilles direkte fra bloddråben, og prøven derfor ikke indeholder nogen tilsætningsstoffer, som favoriserer vedligeholdelse af cellulære strukturer.

Hvis der anvendes venøst blod, skal EDTA imidlertid bruges som et antikoagulant og ikke heparin, da heparin normalt deformerer celler.

Almindelige fejl i Giemsa-farvning

I udøvelsen af denne farvelægning kan der laves fejl. De fremgår af pludselige ændringer i strukturenes tonaliteter.

Ekstremt blå farve

Det kan skyldes:

Meget tyk udstrygning
Overskridelse af farvningstid
Vask utilstrækkeligt.
Anvendelse af reagenser langt over neutral (alkalisk) pH.

Under disse forhold er farverne på de følgende strukturer forvrænget, på en sådan måde, at erytrocytterne i stedet for at farve laksefarvet lyser grønne, granulaterne af eosinofiler, der skal farves mursten, bliver blålige eller grå, og så videre vil der være afvigelse i de sædvanlige toner.

Ekstremt lyserød farve

Det kan skyldes:

Utilstrækkelig farvningstid.
Langvarig eller overdreven vask.
Dårlig tørring.
Anvendelse af stærkt sure reagenser.

I dette særlige tilfælde vil strukturer, der normalt pletter blå, ikke være næsten synlige, mens strukturer, der pletter lyserøde, har meget overdrevne nuancer.

Eksempel: Røde blodlegemer bliver lys rød eller lys orange, kernekromatin vil se lyserosa ud, og eosinophilgranulater farver dybt lys rød.

Tilstedeværelse af bundfald i udstrygningen

Årsagerne kan være:

Brug snavset eller dårligt vasket film.
Lad ikke udstrygningen tørre godt.
Efterlad fixingsløsningen for længe.
Utilstrækkelig vask i slutningen af farvningen.
Utilstrækkelig filtrering eller ingen filtrering af det anvendte farvestof.

Tilstedeværelse af morfologiske artefakter

Morfologiske artefakter kan forekomme i udstrygninger, hvilket gør det vanskeligt at visualisere og fortolke de nuværende strukturer. Dette skyldes:

Type anvendt antikoagulant, såsom heparin.
Brug af beskidte, forringede eller fedtede film.

Opbevaringstilstand

Efter tilberedning skal farvestoffet holdes ved stuetemperatur (15 - 25 ° C) for at forhindre farvestof i at udfældes. Det skal opbevares i en tæt lukket ravbeholder.

Referencer

Cannova D, Brito E og Simons M. Evaluering af farvningsteknikker til diagnose af kutan Leishmaniasis. Salus. 2016 20 (2): 24-29.
PanReac Applichem ITW-reagenser. Giemsa-plet. Version 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanien.
Clark G. Farvningsprocedurer (1981), fjerde. Williams & Willkins.
Anvendt klinisk kemi. Giemsa-plet til in vitro-diagnostik. Distributør: cromakit.es
Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F og Grazioso C. Gyldighed af pletter i Giemsa og Lendrum i konjunktival udstødning til identifikation af Chlamydia trachomatis. Bol af Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
Casas-Rincón G. Generel mykologi. 1994. 2. udg. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
"Giemsa-plet." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 1. september 2017, 01:02 UTC. 6. december 2018, es.wikipedia.org.

GIEMSA-PLET: BEGRUNDELSE, MATERIALER, TEKNIK OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025