GRAMFARVNING: BEGRUNDELSE, MATERIALER, TEKNIK OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den Gram-farvning er den enkleste og mest nyttige farvning teknik i diagnostisk mikrobiologi. Denne teknik blev oprettet af den danske læge Hans Christian Gram i 1884, som formåede at klassificere bakterier som Gram-positiv og Gram-negativ i henhold til cellevæggenes sammensætning.

Teknikken gennemgik visse ændringer af Hucker i 1921 for at stabilisere reagenserne og forbedre kvaliteten af ​​farvningen, hvorfor Gram-pletten også kaldes Gram-Hucker.

Forskellige udstrygninger farvet med Gram-plet. A. Gram-positive cocci. B. Gram-negative stænger. C. Gram-positive, polymorfonukleære og mononukleære baciller. D. Gær.

Med denne teknik er det også muligt at observere formen på mikroorganismerne, det vil sige, hvis de er cocci, baciller, coccobacilli, pleomorf, filamentøs, blandt andre. Samt fordelingen i rummet: i en klynge, i en kæde, isoleret, i par, i tetrader osv.

Når der er mistanke om en bakterieinfektion, skal de fleste af de modtagne prøver smøres på et objektglas og Gram farves til mikroskopisk undersøgelse.

Gram-rapporten vil guide lægen om, hvilken type mikroorganisme der kan være årsagen til infektionen, inden det endelige kulturresultat opnås.

I nogle tilfælde er patientens liv meget kompromitteret, derfor har læger presserende behov for Gram-rapporten for at placere en empirisk behandling, mens de venter på identifikationen af ​​mikroorganismen.

For eksempel, hvis Gram afslører, at der er Gram-positive cocci i cerebrospinalvæsken, vil lægen vejlede den indledende terapi med antibiotika, der eliminerer denne type bakterier, i henhold til de protokoller, der er fastlagt for dette.

Når det endelige resultat kommer med navnet på den isolerede mikroorganisme og dets respektive antiogram, vil lægen vurdere, om behandlingen skal ændres eller ej. Denne beslutning træffes i henhold til undersøgelsen af ​​mikroorganismens følsomhed over for de antibiotika, han modtager, og patientens udvikling.

Basis

Dette er en teknik, der har 4 grundlæggende trin: farvning, fiksering med mordanten, misfarvning og forsænkning. Derfor tillader denne teknik foruden farvning af bakterierne også dem at blive differentieret.

Krystallviolet er den første anvendte farvestof. Det har en affinitet for peptidoglycan og vil plette alle bakterier, der er til stede lilla, derefter placeres lugolen, der fungerer som en mordant, det vil sige, at den vil inducere dannelsen af ​​uopløselige krystalviolet-jodkomplekser - ribonukleære proteiner i cellen..

Gram-positive bakterier, der har en tyk mur af peptidoglycan, danner flere komplekser (krystalviolet-jod), derfor bevarer de farvestoffet.

Derudover påvirker det også, at væggen af ​​Gram-positive bakterier indeholder en større mængde umættede syrer, som viser stor affinitet for oxidationsmidler (Lugol).

I mellemtiden har gram-negative bakterier et tyndt lag peptidoglycan, hvilket får bakterierne til at danne mindre komplekser end Gram-positive.

Derefter kommer misfarvningstrinnet, hvor Gram-positive og Gram-negative bakterier opfører sig forskelligt.

Gram-negative bakterier indeholder en ydre membran rig på lipopolysaccharider, som er en del af deres cellevæg. Fedtstoffer ødelægges ved kontakt med acetonealkohol, så den ydre membran bliver destabiliseret, hvilket frigiver den violette krystal.

Sådan modvirkes det derefter med safranin eller basisk fuchsin, hvorved det bliver rødt.

I tilfælde af Gram-positive bakterier modstår de at falme, fordi blegemidlet fungerer ved at lukke porerne og forhindre, at krystalviolet / jodkomplekset lækker ud.

Derfor forbliver farven med krystalviolet stabil, og der er ikke plads til safranin eller fuchsin. Dette er grunden til, at disse bakterier pletter dybt blå eller lilla.

materialer

Grams farvesæt består af:

• Violet glas
• Lugol
• Acetonalkohol
• Safranin eller basisk fuchsin

Fremstilling af farvestoffer og reagenser

Krystallviolet opløsning

Løsning til:

Violet krystal ------------- 2 gr

Ethylalkohol 95% ----------- 20cc

Opløsning B:

Ammoniumoxalat ----------- 0,8 gr

Destilleret vand ------------- 80 cc

Til den endelige fremstilling af krystalviolet skal opløsning A fortyndes 1:10 med destilleret vand og blandes med 4 dele opløsning B. Blandingen opbevares i 24 timer før brug. Filtrer i en ravfarvet flaske ved hjælp af filterpapir.

Mængden, der skal bruges dagligt, overføres til en ravdråberflaske.

Iod-Lugol

Vej og mål den angivne mængde af hver forbindelse som følger:

Jodkrystaller ------------- 1gr

Kaliumiodid ------------- 2gr

Destilleret vand ------------- 300 cc

Kaliumiodid opløses lidt efter lidt i vandet, og derefter tilsættes jod. Opløsningen barberes i en rav flaske.

Mængden, der skal bruges dagligt, overføres til en mindre ravflaske med en dråber.

blegning

95% Ethylalkohol ----------- 50 ml

Aceton ------------------ 50 ml

Det tilberedes i lige store dele. Dæk godt, da det har en tendens til at fordampe.

Anbring i en dråberflaske.

Dette præparat giver en misfarvning i moderat tid 5-10 sekunder og er den mest anbefalede.

Begyndere foretrækker kun at bruge 95% ethylalkohol, hvor falmning er langsommere end 10 til 30 sek.

Mens de mere erfarne kan bruge ren acetone, hvor misfarvning sker meget hurtigt fra 1 til 5 sek.

Kontrast

Safranin lageropløsning

Safranina -------------– 2,5 gr

Ethylalkohol 95% --------– 100 cc

Efter at have vejet den angivne mængde safranin opløses den i 100 ml 95% ethylalkohol.

Den fungerende safraninopløsning fremstilles ud fra stamopløsningen.

For at gøre dette måles 10 cm3 af stamopløsningen, tilsættes 90 cm3 destilleret vand for at fremstille 100 ml.

Det anbefales at overføre den mængde, der skal bruges dagligt, til en rav flaske med en dråber.

Mikroorganismer, der pletter svagt Gram-negativt med Gram-Hucker-pletten, såsom visse anaerober, Legionella sp, Campylobacter sp og Brucella sp, kan farves meget bedre ved hjælp af Kopeloffs ændring af Gram-Hucker-pletten, kaldet Gram-Kopeloff-plet.

Denne teknik ændrer safraninfarvestoffet til basisk fuchsin. Med denne modifikation er det muligt effektivt at farve de nævnte mikroorganismer.

Reagensopbevaring

Forberedte farvestoffer skal opbevares ved stuetemperatur.

Forberedelse af udstrygningen af ​​prøven, der skal farves

En prøve skal indeholde mindst 10 ⁵ mikroorganismer før observation af mikroorganismen i et smear er sandsynlig. Udstrygninger kan fremstilles fra den direkte prøve eller fra kulturer i faste eller flydende medier.

Udstrygningerne skal være ensartede, godt fordelt og ikke for tykke for en bedre visualisering af de tilstedeværende strukturer.

-Grammet af direkte prøver

Gram af ucentrifugeret urin

Urinen blandes, og 10 µl placeres på et objektglas. Observationen af ​​mindst et bakterie / Dip-felt indikerer, at der er en infektion.

Det betyder, at kulturen vil have tilnærmelsesvis mere end 100.000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) fra urin i 85% af tilfældene.

Denne metode er ikke nyttig til kolonitællinger under 100.000 CFU.

CSF Gram

CSF skal centrifugeres, supernatanten fjernes og pelleten spredes på et objektglas. Denne væske er steril under normale forhold; observation af bakterier indikerer infektion.

Gram af åndedrætsprøver

Sputum, bronchial eller bronchoalveolar lavage Gram, selvom der kan være en række forskellige mikroorganismer, vil altid være vejledende for diagnosen ud over at være nyttig i den observerede type celler.

I tilfælde af sputum skal udstrygningen tilberedes med de mest purulente dele af prøven.

Gram af afføring

Det anbefales ikke at udføre et Gram på denne type prøver, da det ikke har nogen diagnostisk værdi.

-Grøm af afgrøder

De kan udføres på to måder, den ene fra flydende kulturer og den anden fra faste kulturer.

Flydende kulturer

Fra flydende kulturer er det ekstremt enkelt; Flere stag af den overskyede bouillon tages under brænderen og placeres på et rent og tørt objektglas, hvorved der foretages cirkulære bevægelser fra midten mod periferien for at fordele materialet jævnt.

Lad det tørre spontant i luften. Når det er tørt, fastgøres materialet på arket med varme. For at gøre dette, ved hjælp af en pincet, føres arket 3 til 4 gange gennem flammen af ​​Bunsen-brænderen, og pas på ikke at brænde materialet.

Arket får lov til at afkøle og placeres på farvelægebroen.

Faste afgrøder

For at udføre en udtværing for Gram-plet fra en fast kultur, skal du gøre som følger:

Inden du vælger de kolonier, der skal tages, skal objektglasset være klar til at placere ca. to dråber steril fysiologisk saltopløsning.

Hvis den originale kulturplade indeholder flere forskellige typer kolonier, vil en isoleret koloni af hver blive valgt til at udføre Gram. Hver koloni tages med platineløkken for at opløses i den saltopløsning, der tidligere var placeret på objektglasset.

Cirkulære bevægelser foretages fra midten mod periferien for homogent at fordele kolonien på objektglasset.

Lad det tørre spontant i luften. Når det er tørt, fastgøres arket med varme, som tidligere forklaret (ved at flamme objektglasset med lighteren), og pas på ikke at brænde materialet.

Denne procedure skal udføres med hver anden type koloni. På et stykke papir skal rækkefølgen af, hvad der observeres, bemærkes, for eksempel:

Koloni 1: Betahæmolytisk gul koloni: Gram-positive cocci blev observeret i klynger

Koloni 2: Flødefarvet koloni uden hæmolyse: Gram-negative coccobacilli blev observeret.

Hvert lysbillede skal være mærket for at vide, hvad vi observerer.

Teknik

Gram-farvningsteknikken er ekstremt let at udføre og relativt billig og kan ikke gå glip af i et mikrobiologisk laboratorium.

Det gøres som følger:

1. Fastgør udstrygningen med varme og placer på farvebroen.
2. Dæk objektglasset helt med krystalviolet i 1 minut.
3. Vask af med vand Tør ikke
4. Dæk arket med lugolopløsning, lad det virke i 1 minut. Vask af med vand Tør ikke.
5. Bleg i 5-10 sekunder med forsigtig omrystning i alkoholaceton. Eller placer arket i en lodret position og slip dråber af affarvningsmidlet på overfladen, indtil overskuddet af ikke-tilbageholdt violet glas er fjernet. Må ikke overskrides.
6. Vask af med vand Tør ikke.
7. Udskift slæden på farvningsbroen og dæk i 30 sekunder med safranin (Gram-Hucker) eller 1 min med basisk fuchsin (Gram-Kopeloff).
8. Vask med vand
9. Lad den lufttørre spontant i en lodret position.

Når den er tør, placeres en dråbe nedsænkningsolie for at observere den under 100X-objektivet i lysmikroskopet.

Utility

Denne teknik gør det muligt at skelne de morphotintorale forskelle mellem de fleste bakterier.

Gær adskiller sig også ved denne farve. De tager krystalviolet, det vil sige, de pletter Gram positivt.

På den anden side kan der skilles mellem spordannende Gram-positive baciller, hvori der observeres et klart rum inden i bacillus, hvor endosporen dannes, skønt sporer ikke pletter godt. Andre teknikker, såsom Shaeffer-Fulton, bruges til at plette sporer.

Det skal bemærkes, at denne farvning ikke bruges til at farve alle typer bakterier, dvs. der er tilfælde, hvor farvningen ikke fungerer.

I dette tilfælde kan bakterier, der mangler en cellevæg, nævnes. For eksempel: slægten Mycoplasma, sfæroplaster, ureaplasma, L-former og protoplaster.

Det pletter også meget dårligt bakterier med vægge rige på mykolsyrer, såsom Mycobacteria, og intracellulære bakterier såsom Chlamydias og Rickettsias.

Det er også ineffektivt ved farvning af de fleste spirochetale bakterier.

Der er bakterier af samme slægt, der kan observeres i den samme prøve som Gram-positiv og Gram-negativ. Når dette sker kaldes det variabel gramfarvning, hvilket kan skyldes ændring i næringsstoffer, temperatur, pH eller elektrolytkoncentration.

Almindelige fejl

Overdreven blegning

Overdrivelse i misfarvningstrinnet kan føre til observation af falske gram-negative mikroorganismer.

Venter ikke længe nok tørretid til at tilføje nedsænkningsolien

Det kan forårsage, at Gram-positive bakterier pletter Gram-negativ (falsk Gram-negativ). Dette sker, fordi der i gamle kulturer sandsynligvis er døde eller forkælet bakterier, og under disse forhold bibeholder bakterierne ikke krystalviolet.

Brug meget gammel lugolopløsning:

Med tiden mister lugolen sine egenskaber, og dens farve falmer. Hvis det allerede degenererede reagens anvendes, vil det ikke fikse krystalviolet godt, og der er derfor en mulighed for at få en visualisering af falsk Gram-negative mikroorganismer.

Blå baggrund

En korrekt misfarvet baggrund vil være rød. En blå baggrund indikerer, at misfarvningen var utilstrækkelig.

Referencer

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medicinsk mikrobiologi, 6. udgave McGraw-Hill, New York, USA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. (5. udgave). Argentina, Redaktion Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Argentina. Redaktionel Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Generel mykologi. 2. udg. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
5. "Gram-plet." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 4 okt. 2018, 23:40 UTC. 9. december 2018, 17:11. Taget fra es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manual of Medical Microbiology. 2. udgave, Venezuela: Direktoratet for medier og publikationer fra University of Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Grundlæggende pletter i mikrobiologilaboratoriet. Forskning inden for handicap. 2014, 3 (1): 10-18.