WRIGHTS PLET: BEGRUNDELSE, MATERIALER, TEKNIK OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den Wright plet er en farvning teknik skabt af den amerikanske patolog James Homer Wright i 1902, baseret på Romanowsky- pletten. Da Romanowsky-pletten var ustabil, inkorporerede Wright methanol som opløsningsmiddel og fikseringsmiddel.

Denne farve er polykromatisk, hvilket betyder, at den genererer flere farver afhængigt af strukturen, der absorberer farvestoffet. Denne farvningsteknik er blevet vidt anvendt til at udføre differentielle antal hvide blodlegemer og til at undersøge morfologien af ​​røde blodlegemer, blodplader og leukocytter i perifert blod og knoglemarv.

Forskellige perifere blodudstrygninger farvet med Wrights plet. A. Akut leukæmi B. Plasmodium vivax i erythrocyten. C. Plasmodium falciparum, makrogametocyt. D. Lymfocyt

Dets anvendelse er meget vigtig, da der kan ses abnormaliteter i de forskellige cellelinjer i blodet, hvilket letter diagnosen sygdomme såsom leukæmi eller bakterielle eller parasitære infektioner.

Måske er dette de mest almindelige applikationer, hvor denne teknik anvendes, men de er ikke de eneste. Det er også nyttigt i andre prøver end blod og knoglemarv, såsom næseudladning, fækalt slim, sputum, hudprøver, blandt andre.

Begrundelse for Wrights plet

Wrights plet blev født fra Romanowskys plet, der består af en methylalkoholopløsning af et surt farvestof (eosin Y) og et basisk farvestof (methylenblåt) og deres oxidationsprodukter.

Blandingen af ​​farvestoffer, der bruges i Wrights plet, forårsager effekten kendt som Romanowsky, det vil sige, den giver en smuk lilla farve til kernerne i leukocytter og neutrofile granuler, mens de røde blodlegemer farves lyserøde.

Komponenterne, der er ansvarlige for at give den typiske farveskala fra Wrights farve, er blå B og eosin Y. Den observerede virkning afhænger af bindingen af ​​farvestofferne til kemiske strukturer og interaktionerne mellem blå B og eosin Y.

Sure strukturer, såsom nukleinsyrer, nukleare proteiner og den reaktive umodne cytoplasma af nogle celletyper, fikserer blå B (basisfarvning).

Mens basiske strukturer, såsom hæmoglobin, binder granulaterne af segmenterede eosinofiler, blandt andre cellulære strukturer, eosin Y (syrefarvestof).

Farvningsresultatet kan påvirkes af forskellige faktorer, såsom pH i Wright-farvestoffet, pufferen og vaskeopløsningen; samt farvning og fikseringstid.

Derfor er hvert trin i fremstillingen af ​​reagenserne afgørende og skal udføres under hensyntagen til enhver detalje.

materialer

Wrights plet. For 100 ml kræves det:

Vej 0,3 g Wrights plet, mål 97 ml methanol og 3 ml glycerol.

Forberedelse

I en morter anbringes den tunge mængde af Wrights farvestof og integreres gradvist glycerolen, indtil pulveret er helt opløst.

Derefter tilsættes methanolen, blandes og hældes i en rav flaske.

Inden brug skal opløsningen rystes med blide bevægelser og filtreres.

Bufret bufferopløsning

I en liter destilleret vand, 3,76 g dinatrium hydrophosphate (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) plus 2,1 g dihydrogen kaliumphosphat (KH ₂ PO ₄ tilsættes).

Bland meget godt, indtil alle inkorporerede reagenser er opløst. Juster pH til 7,2. Hæld i en glasbeholder og hold ved stuetemperatur.

Yderligere materialer, der er nødvendige for at udføre farvelægningen

Derudover kræves andre materialer for at være i stand til at udføre farvningsteknikken, disse er: objektglider eller dækker genstande, farvelægebro, t-shirts med vand eller buffer til vask, en timer til at holde farvetiderne og noget tørremateriale (absorberende papir, gasbind eller bomuld).

Komponenter af Wrights plet

methanol

Alkohol (methanol) fungerer som et fikseringsmiddel for blodudstrygningen til objektglasset.

Det er dybest set et koaguleringsmiddel, der reducerer, dehydrerer og fikserer reagens. Derfor er dens funktion at koagulere proteiner og gøre dem uopløselige, men uden at denaturere dem faktisk.

Methanol er det mest udbredte reaktionsmiddel til smørefiksering i alle laboratorier, da det giver bedre resultater end ethanol. Den ideelle koncentration er 99%.

Dæmper

Pufferen (bufret opløsning) har funktionen af ​​at justere eller opretholde farvestoffets pH-værdi, da en pH-værdi, der er indstillet til 7,2, er essentiel for, at cellestrukturerne kan absorbere farvestofferne korrekt.

På den anden side dehydratiserer methanolfikseringstrinnet cellerne, og bufferen hjælper med at rehydratisere dem.

Eosin (Y)

Eosin har en affinitet for byggesten, fordi det er et syrefarvestof. To typer eosin er kendt meget ligner hinanden, så meget, at en af ​​de to kan bruges, hvilket opnår det samme resultat.

Den ene kaldes eosin Y, gul eosin eller tetrabromofluorescein, og den anden kaldes eosin B, blålig erythrosin B eller dibromodinitrofluorescein. Eosin Y er dog det mest anvendte.

Den vigtigste egenskab ved dette farvestof er dets negative polaritet, hvilket gør det tiltrukket af positivt ladede cellestrukturer.

Methylenblå

Det er den grundlæggende farve. Dets vigtigste egenskab er metachroma, det vil sige, at ikke alle strukturer vil blive farvet i samme farve, det afhænger af den kemiske sammensætning af de strukturer, der farves.

Nogle vil blive lys eller mørkeblå, og andre vil blive mørk lilla eller lys syrin.

Teknik

1-Udfør spredningen af ​​prøven, så der forbliver en tynd film, enten på et objektglas eller et dækglas.

2-Lad det tørre i luften i cirka 2 timer.

3-Anbring det tørre udstrygning på farvebroen eller farvningsbakken med prøvespredningen opad.

4-dæk arket med Wright-pletten drop for drop, indtil hele overfladen er dækket. Lad stå i 5 - 8 minutter.

5-Pletten skal dække slæden helt uden at spildes over kanterne. Hvis det begynder at fordampe i løbet af farvetiden, tilsættes et par ekstra dråber.

6 - Tilsæt derefter en lige stor mængde støddæmper, blæse lidt, indtil den karakteristiske metalliske glans vises. Tid 10 til 15 minutter.

7-Vask med ledningsvand, anbring den bløde strøm, indtil arket ser lyserødt ud.

8-Fjern farvestoffet, der klæber fast på bagsiden af ​​objektglaset, med en gasbind, der er gennemvædet i alkohol.

9-Lad udstrygningen tørre meget godt, inden du placerer nedsænkningsolien for at se den under mikroskopet.

Utility

Hæmatologi

Det er ideelt til farvning af perifert blodudstrygning, til undersøgelse af tyk blodudstrygning og til undersøgelse af celler fra knoglemarvsprøver.

På grund af de kemiske egenskaber ved denne kombination af farvestoffer kan cellestrukturer let genkendes, og de forskellige typer celler, der er til stede, kan skelnes.

Løbende næse

Denne teknik er meget nyttig til at identificere cellerne fra næseudladningen (epitelceller, segmenterede eosinofiler, polymorphonuclearceller) ved diagnosen af ​​allergisk rhinitis.

parasitologi

I denne forstand har det været nyttigt til undersøgelsen af ​​Leishmania sp inden for histiocytter af det subkutane cellulære væv i hudsår. Ligeledes bruges det til at identificere leukocytter i afføringsprøver (fækal leukogram).

I dette tilfælde er det af interesse for lægen at vide, om leukocytosen, der findes i afføringen, er polymorfonuklear eller mononukleær. Dette fund i fækal leukogrammet vil lede, om det er henholdsvis en bakterie- eller virusinfektion.

På den anden side kan parasitter, der cirkulerer i blodet, findes i erythrocyten eller fri i plasma. De parasitter, der søges, er Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii og filarias, og inden for veterinærmedicin er det nyttigt i søgningen efter Theileria equi og Babesia caballi, kausale midler til bebesiosis, især hos heste.

Wright-pletten og også Giemsa-pletten gør det muligt at differentiere hæmoparasitter fra normale cellulære komponenter. To typer opslag kan bruges til dette:

Spred tynd

Blod spredes som en tynd film på et lysbillede. Det er farvet med Wrights plet, hvilket afslører egenskaberne ved kernen og cytoplasma.

Tykt fald

Denne metode anvendes til at undersøge tilstedeværelsen af ​​parasitter i en større mængde blod.

For at gøre dette anbringes en stor dråbe blod på et objektglas. Når den først er der, skal den defibrilleres og lave større og større cirkler fra midten udad ved hjælp af kanten på et andet objektglas.

Endelig, for at være i stand til at observere parasitterne i den tykke udtværing, skal erythrocytterne lyseres med vand.

Luftvejsinfektioner

På respirationsniveau er denne teknik også nyttig, da cellerne, der findes i prøverne af sputum, bronchial skylning eller bronchoalveolar, er vigtige for at etablere diagnosen.

På lignende måde kan polymorfonukleære celler og mononukleære celler her skelnes.

bakteriologi

Brugen af ​​denne teknik i bakteriologi er begrænset, fordi den ikke er god til farvning af bakterier, hvorfor andre specialiserede farvningsteknikker bruges til deres farvning.

Imidlertid er det blevet brugt til at søge efter epitelceller med Chlamydia trachomatis inklusionskropper i urethral eller endocervikal slimhindesmuds, selvom det må erkendes, at det ikke er den bedste metode til dette.

Det er også muligt at observere spirallignende bakterier, såsom Borrelia burgdorferi, blandt røde blodlegemer hos inficerede patienter, såvel som morulae eller inklusionslegemer af Ehrlichia sp i cytoplasma af lymfocytter, monocytter eller neutrofiler i en blodudstrygning.

mykologi

Histoplasma capsulatum er en patogen svamp, der ofte diagnosticeres ved mikroskopisk observation af forskellige vævsprøver farvet med Wrights plet.

Hvordan observeres strukturerne i blodprøven med Wrights plet?

Kilde: Retamales E, Mazo V. Institut for folkesundhed, Chiles regering. Anbefalinger til farvning af blodudstrygning ved læsning af hæmogrammet.

Anbefalinger til god farvning

Blodprøveglas skal tørre spontant. Udstrygninger skal være så tynde som muligt for at opnå bedre fiksering af farvestoffet og undgå overfarvning.

Til farvning af høj kvalitet anbefales det at plette inden for to timer efter udstrygning af udstrygningen. På den anden side er den ideelle prøve kapillærblod uden antikoagulant.

Hvis venøst ​​blod imidlertid anvendes, skal det bruges som et antikoagulerende EDTA og ikke heparin, da sidstnævnte kan deformere cellestrukturer.

For at undgå forringelse af det forberedte farvestof skal det opbevares på tørre steder.

Under vaskeprocessen anbefales brug af vand justeret til en neutral pH.

Endelig er det tilrådeligt at teste de farvningsmetoder, der anvendes i laboratoriet fra tid til anden.

Dette gøres ved at farve prøver eller udvide mønstre som en kvalitetskontrol. Dette trin er vigtigt, da det sikrer, at farvningen er korrekt forberedt, og farvningstiderne er godt standardiserede.

Hvis mønsterarket er dårligt farvet, er der problemer, der skal løses.

Almindelige fejl i Wright-farvning

Meget lys farvning

Meget bleg udstrygning skyldes normalt en meget kort farvetid eller overdreven vask. Det korrigeres ved at forlænge kontakttiden med farvestoffet eller reducere vasketiden.

Farvestof udfældes

Tilstedeværelsen af ​​bundfald af farvestof i udstrygningen kan have flere årsager, men de hyppigste årsager er: brug af ufiltreret farvestof, farvning på ujævne farvebroer, brug af ark, der er beskidt med støv eller fedt, ikke vaskes godt komplet farvning.

Ekstremt rød eller blå udstrygning

Bufferen er ansvarlig for farvestoffets pH. Farvestoffer med en pH-værdi under det indikerede (sure) vil resultere i meget rødlige udstrygninger.

Hvis farvestoffets pH er over (alkalisk) opnås en ekstremt blålig udtværing.

Opbevaringstilstand

Reagenset skal opbevares ved stuetemperatur.

Referencer

1. Gutiérrez V. Sammenligningsundersøgelse mellem Wright-farvningsmetoden og Elisa-testen til diagnose af hunde Ehrlichiosis i byen San Pedro Sula, Honduras. 2008. Gradeksamen for at kvalificere sig til den veterinærmedicinske grad. San Carlos universitet i Guatemala.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Grundlæggende pletter i mikrobiologilaboratoriet. Forskning inden for handicap. 2014, 3 (1): 10-18.
3. "Wrights plet." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 18. maj 2018, 12:05 UTC. 8 dec. 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frees of Babesia spp. i jagtheste, Córdoba (Colombia). Pastor udcaactual divulgient. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Argentina. Redaktionel Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Institut for Chile for folkesundhed. Anbefalinger til farvning af blodudstrygning ved læsning af hæmogrammet.