ZIEHL-NEELSEN-FARVNING: BEGRUNDELSE, REAGENSER OG TEKNIK - BIOLOGI - 2025

Den Ziehl-Neelsen en farvning teknik til at identificere mikroorganismer resistente alkohol syre (ARA). Navnet på denne mikrobiologiske procedure henviser til dens forfattere: bakteriolog Franz Ziehl og patolog Friedrich Neelsen.

Denne teknik er en type differentiel farvning, som involverer brug af forskellige farvestoffer for at skabe kontrast mellem de strukturer, du vil observere, differentiere og senere identificere. Ziehl-Neelsen-pletten bruges til at identificere visse typer mikroorganismer.

Ziehl-Neelsen-plet

Nogle af disse organismer er mycobacteria (f.eks. Mycobacterium tuberculosis), nocardia (f.eks. Nocardia sp.) Og nogle enkeltcelleparasitter (f.eks. Cryptosporidium parvum). Mange af bakterierne kan klassificeres ved hjælp af en almindelig teknik kaldet en Gram-plet.

Nogle bakteriegrupper kræver imidlertid andre metoder for at være i stand til at identificere dem. Teknikker som Ziehl-Neelsen-pletten kræver kombinationer af farvestoffer med varme for at fastgøre førstnævnte til cellevæggen.

Derefter kommer en blegningsproces, der giver mulighed for to resultater: modstand eller følsomhed over for misfarvning af syrer og alkoholer.

Basis

Begrundelsen for denne farvningsteknik er baseret på egenskaberne af cellevæggen i disse mikroorganismer. Væggen består af en type fedtsyrer kaldet mykolsyrer; Disse er kendetegnet ved at have meget lange kæder.

Når fedtsyrer har meget lange strukturer, kan de lettere bevare farvestoffer. Nogle bakterielle slægter er meget vanskelige at plette ved Gram-farvning på grund af det høje indhold af mykolsyrer i cellevæggen.

Ziehl-Neelsen-pletten bruger den phenoliske forbindelse carbol fuchsin, en grundlæggende plet. Dette har evnen til at interagere med fedtsyrerne i cellevæggen, som er voksagtig i struktur ved stuetemperatur.

Carbol-fuchsin-farvning forbedres i nærværelse af varme, fordi voksen smelter, og farvestofmolekylerne bevæger sig hurtigere ind i cellevæggen.

Den syre, der senere bruges, tjener til at misfarve celler, der ikke blev farvet, fordi deres væg ikke var tilstrækkeligt relateret til farvestoffet; derfor er styrken af ​​syreblegemet i stand til at fjerne syrefarvestoffet. Celler, der modstår denne misfarvning kaldes syrehurtig.

Sekundær farvestof

Efter affarvning af prøven kontrasteres den med et andet farvestof kaldet sekundært farvestof. Generelt anvendes methylenblåt eller malachitgrønt.

Det sekundære farvestof farver baggrundsmaterialet og skaber følgelig kontrast til de strukturer, der blev farvet i det første trin. Kun misfarvede celler absorberer det andet farvestof (forsænket) og tager deres farve, mens syresnelle celler bevarer deres røde farve.

Denne procedure bruges ofte til identifikation af Mycobacterium tuberculosis og Mycobacterium leprae, der kaldes syrehurtige baciller.

Reagenser

Primær farvestof

Der anvendes 0,3% carbol-fuchsin (filtreret). Dette farvestof fremstilles ud fra en blanding af alkoholer: phenol i ethanol (90%) eller methanol (95%), og i denne blanding opløses 3 gram basisk fuchsin.

Blegemiddelopløsning

I dette trin kan opløsninger af 3% alkoholisk syre eller 25% svovlsyre anvendes.

Sekundær farvestof (modfarvestof)

Det farvestof, der er mest brugt til at kontrastere prøverne, er normalt 0,3% methylenblåt. Andre kan imidlertid også bruges, såsom 0,5% malachitgrøn.

Teknik

Procedure med syrehurtig farvning

Forbered en bakteriel udstrygning

Dette præparat udføres på et rent, tørt objektglas efter sterilitetsforholdsregler.

Tørret udtværing

Lad udstrygningen tørre ved stuetemperatur.

Opvarm prøven

Prøven skal opvarmes ved at påføre ild på røret nedenfor. En alkoholfiksering kan udføres, når udstrygningen ikke er blevet fremstillet med sputum (behandlet med natriumhypochlorit for at gøre den hvidere), og hvis den ikke pletter straks.

M. tuberculosis fjernes med blegemiddel og under farvningsprocessen. Varmefiksering af ubehandlet sputum dræber ikke M. tuberculosis, mens alkoholfiksering er bakteriedræbende.

Dæk pletten

Pletten er dækket med carbol-fuchsin-opløsningen (primær grundlæggende plet).

Varm pletten

Dette gøres i 5 minutter. Du skal bemærke en udvikling af damp (ca. 60 ° C). Det er vigtigt ikke at overophedes og undgå at brænde prøven.

Med hensyn til opvarmning af pletten skal der udvises stor omhu ved opvarmning af carbol-fuchsin, især hvis farvningen udføres på en bakke eller en anden beholder, hvori der er samlet meget brandfarlige kemikalier fra den tidligere farvning.

Kun en lille flamme skal påføres under lysbillederne ved hjælp af en tidligere tændt pinde fugtet med et par dråber sur alkohol, methanol eller 70% ethanol. Undgå at bruge en stor vatpinde, der er gennemvædet med ethanol, da dette er brandfare.

Vask pletten

Denne vask skal udføres med rent vand. Hvis vandet fra hanen ikke er rent, skal du fortrinsvis vaske udstrygningen med filtreret eller destilleret vand.

Dæk udstrygningen med sur alkohol

Denne sure alkohol bør være på 3%. Dækning udføres i 5 minutter, eller indtil udstrygningen er tilstrækkelig misfarvet, dvs. lyserosa i farve.

Det skal tages i betragtning, at sur alkohol er brandfarlig; derfor skal det bruges med stor omhu. Undgå at være i nærheden af ​​antændelseskilder.

Vask pletten

Vask skal ske med rent, destilleret vand.

Dæk udstrygningen med plet

Det kan være malachitgrønt (0,5%) eller methylenblåt (0,3%) farve i 1 til 2 minutter ved at bruge den længere tid, hvis udstrygningen er tynd.

Vask pletten

Igen skal der bruges rent (destilleret) vand.

At dræne

Bagsiden af ​​objektglasset skal rengøres, og pletten placeres på et drænerør for at lade det tørre i luften (brug ikke absorberende papir til tørring).

Undersøg udstryk under mikroskopet

100X objektiv og nedsænkningsolie skal bruges. Scan smøret systematisk, og registrer de relevante observationer.

Fortolke resultaterne

Teoretisk betragtes mikroorganismer, der pletter en rødlig farve, syrehurtige positive (AAR +).

Tværtimod, hvis mikroorganismerne pletter blå eller grøn, afhængigt af farvestoffet anvendt som modfarve, betragtes de som syrehurtige negative (AAR-).

Referencer

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (1. udg.). Jaypee Brothers Medical Publisher.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologi med sygdomme ved kropssystem (4. udg.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Introduktionsmikrobiologi (1. udg.). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratoriehåndbog og arbejdsbog i mikrobiologi: Anvendelser til patientpleje (11. udg.). McGraw-Hill Uddannelse.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Tekstbog til mikrobiologi (1. udg.). BI Publications PVT.