REKOMBINANT DNA: TEKNIK, APPLIKATIONER OG FUNDAMENTALS - BIOLOGI - 2025

Det rekombinante DNA (rDNA eller rDNA) er et kunstigt nukleinsyremolekyle oprettet i laboratoriet ved at integrere to segmenter af interesseorganisationer. Det er også kendt som kimært DNA takket være dets hybridegenskab. Denne type DNA findes ikke i naturen.

Den grundlæggende metode til generering af den inkluderer: (a) selektion af et mål-DNA og dets indsættelse i et andet DNA-fragment (generelt et bakterieplasmid); (b) introduktion af dette plasmid i en bakterie, (c) selektion af bakterierne ved hjælp af antibiotika og til sidst (d) ekspression af genet.

Kilde: pixabay.com

Teknikken drager fordel af et sæt enzymer, der gør det muligt at kopiere og indsætte specifikke DNA-fragmenter efter forskerens vurdering.

Målet med rekombinant teknologi er i de fleste tilfælde udtrykket af et protein (kendt som et rekombinant protein) ønsket af molekylærbiologen til fremtidig forskning eller at skabe et protein med kommerciel og terapeutisk værdi - såsom human insulin, for eksempel.

Grundlæggende om den rekombinante DNA-teknik og dens anvendelse i genteknologi

Det centrale dogme i molekylærbiologi

Alle organiske væsener, som vi kender, deler flere egenskaber. En af dem er arten af ​​det genetiske materiale og den måde, proteiner fremstilles på - en proces, der er kendt som det centrale ”dogme” i molekylærbiologi.

Med undtagelse af et par vira lagrer alle organismer genetisk information i DNA (deoxyribonukleinsyre), indsamlet på en meget kompakt og organiseret måde i cellekernen.

Til genekspression transkriberes DNA-molekylet til messenger-RNA, og sidstnævnte oversættes til sproget for aminosyrer, byggestenene til proteiner.

Hvad er et rekombinant DNA?

Mellem 1970'erne og 1980'erne begyndte molekylærbiologer at drage fordel af de processer, der naturligt forekommer inde i cellen og var i stand til at ekstrapolere dem til laboratoriet.

På denne måde kunne et gen af ​​animalsk oprindelse (f.eks. Et hvirveldyr) indsættes i et DNA-segment fra en bakterie; eller en bakteries DNA kunne kombineres med et viralt DNA. Således kan vi definere et rekombinant DNA som et molekyle, der består af DNA fra to forskellige organismer.

Når dette hybrid eller rekombinant molekyle er blevet dannet, udtrykkes genet af interesse. Med ordudtrykket ønsker vi at henvise til processen med oversættelse til protein.

Restriktionsenzymer og ligaser: nøglen til processen

Et vigtigt element i udviklingen af ​​rekombinant DNA-teknologi var opdagelsen af ​​restriktionsenzymer.

Dette er proteinmolekyler, der udviser evnen til at spalte DNA (nukleaser) i specifikke sekvenser, der tjener som ”molekylsaks”. Fragmenterne genereret af disse enzymer kaldes restriktionsfragmenter.

Nævnte enzymer kan producere symmetriske snit i målsekvensen (i begge kæder i samme højde) eller asymmetriske snit. Et centralt aspekt af virkningen af ​​restriktionsenzymer er, at efter spaltningen af ​​kæderne opnås en "løs kant", komplementær til den anden kant, der er skåret af det samme enzym.

Nogle eksempler er ECOR 1 og Sma 1. I øjeblikket er mere end 200 typer restriktionsenzymer kendte og kommercielt tilgængelige.

For at være nyttig skal en saks ledsages af limen. Denne tætningsvirkning af DNA'et (tidligere behandlet med restriktionsenzymer) udføres af ligaser.

Teknik: hvordan er DNA fra en organisme kunstigt ændret i laboratoriet?

Nedenfor beskriver vi de vigtigste trin, som rekombinant DNA-teknologi kræver. Alle udføres af fagfolk i et molekylærbiologilaboratorium.

Hvad er en "klon"?

Før vi fortsætter med den eksperimentelle protokol, skal vi bemærke, at i molekylærbiologi og bioteknologi bruges udtrykket "klon" og verbet "klon" i vid udstrækning. Dette kan føre til forvirring.

I denne sammenhæng refererer vi ikke til kloning af en hel organisme (som for eksempel den berømte får Dolly), men til kloning af et stykke DNA, der kan være et gen. Det vil sige at producere mange eksemplarer - genetisk identiske - af sekvensen.

1. Isolering og opnåelse af DNA

Det første trin er at beslutte, hvilken sekvens du vil bruge. Dette afhænger helt af forskeren og målsætningerne for hans arbejde. Dette DNA skal derefter isoleres og oprenses. Metoderne og procedurerne for at opnå dette afhænger igen af ​​kroppen og vævet.

Generelt tages en del af væv og underkastes behandling i en lysebuffer med proteinase K (et proteolytisk enzym), og derefter ekstraheres DNA'et. Derefter fragmenteres det genetiske materiale i små fragmenter.

2. Kloningsvektor

Efter de forberedende trin søger forskeren at introducere DNA-segmentet af interesse i en kloningsvektor. Fra nu af kalder vi dette segment af DNA hvidt DNA.

plasmider

En af de mest anvendte vektorer i et plasmid af bakteriel oprindelse. Et plasmid er et dobbeltstrenget, cirkulært DNA-molekyle, der findes naturligt i bakterier. De er fremmed for bakteriekromosomet - det vil sige at de er ekstrakromosomale og findes naturligt i disse prokaryoter.

De grundlæggende elementer i en vektor er: (a) en replikationsorigin, som tillader DNA-syntese; (b) selektionsmiddel, som gør det muligt at identificere de organismer, der bærer plasmidet med mål-DNA, såsom resistens over for noget antibiotikum; og (c) multikloningssted, hvor sekvenserne, der vil blive genkendt af restriktionsenzymerne, findes.

Det første succesrige rekombinante DNA i laboratoriet blev klonet ind i plasmidet pSC101 fra bakterien E. coli. Dette indeholder et restriktionssted for restriktionsenzymet EcoRI og et gen til resistens over for et antibiotikum ud over replikationsoriginen.

Indsættelsen af ​​mål-DNA'et i plasmidet udføres under anvendelse af de molekylære værktøjer til restriktionsenzymer og ligaser beskrevet i det foregående afsnit.

Resterende vektortyper

Ud over plasmider kan DNA indsættes i en anden vektor, såsom bakteriofag-lambda, kosmider, YAC'er (kunstige gærkromosomer), BAC'er (bakterielle kunstige kromosomer) og fagemider.

3. Introduktion af rekombinant DNA

Når det rekombinante DNA-molekyle (gen af ​​interesse i plasmidet eller anden vektor) er opnået, indføres det i en vært eller værtsorganisme, der kan være en bakterie.

For at introducere fremmed DNA i en bakterie anvendes en teknik kaldet bakterietransformation, hvor organismen underkastes en behandling med divalente kationer, der gør den modtagelig for optagelse af DNA.

Metodologisk kan vi ikke garantere, at 100% af bakterierne i vores kultur effektivt har optaget vores rekombinante DNA-molekyle. Det er her den del af plasmidet, der indeholder antibiotikaresistens, spiller ind.

De bakterier, der har optaget plasmidet, vil således være resistente over for et bestemt antibiotikum. For at vælge dem vil det være nok at anvende det nævnte antibiotikum og tage de overlevende.

4. "Høst" proteinet

Når vi har valgt bakterierne med vores rekombinant DNA, fortsætter vi med at bruge værtens enzymatiske maskiner til at generere proteinproduktet af interesse. Når bakterierne formerer sig, overføres plasmidet til deres afkom, så det går ikke tabt under opdelingen.

Denne procedure bruger bakterierne som en slags protein "fabrik". Senere vil vi se, at det har været en meget relevant procedure i udviklingen af ​​effektive medicinske behandlinger.

Når kulturen er klar, og bakterierne har produceret store mængder protein, lyseres eller forstyrres cellen. Der er en lang række biokemiske teknikker, der tillader oprensning af proteiner i henhold til deres fysisk-kemiske egenskaber.

I en anden eksperimentel kontekst er vi måske ikke interesseret i at generere proteinet, men snarere er vi interesseret i at opnå DNA-sekvensen i sig selv. Hvis dette var tilfældet, ville plasmidet blive brugt til at skabe flere kopier af fragmentet af interesse for at have nok af mål-DNA'et til at udføre de relevante eksperimenter.

Applikationer

Rekombinant DNA-teknologi åbnede et uendeligt antal muligheder inden for molekylærbiologi, bioteknologi, medicin og andre beslægtede områder. Dets mest fremragende applikationer er følgende.

Genetisk analyse

Den første anvendelse er direkte relateret til molekylærbiologilaboratorier. Rekombinant DNA-teknologi gør det muligt for forskere at forstå den normale funktion af gener, og de genererede proteiner kan bruges til yderligere forskning.

Farmaceutisk industri

Proteiner produceret under anvendelse af den rekombinante DNA-procedure har anvendelser inden for medicin. To meget relevante eksempler på området er humant insulin og væksthormon, som anvendes til patienter, der mangler dette protein.

Takket være rekombinant DNA kan disse proteiner genereres uden behov for at ekstrahere dem fra et andet menneske, hvilket repræsenterer yderligere metodologiske komplikationer og sundhedsrisici. Dette har bidraget til at forbedre livskvaliteten for utallige patienter.

Referencer

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Biologi 2. Grupo Redaktionelle Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE & Hausman, RE (2000). Cellen: en molekylær tilgang (bind. 10). Washington, DC: ASM-presse.
3. Devlin, TM (2004). Biokemi: lærebog med kliniske anvendelser. Jeg vendte om.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Roll af rekombinant DNA-teknologi til forbedring af livet. International tidsskrift for genomik, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Patologisk anatomi. Elsevier Spanien.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Introduktion til mikrobiologi. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Human insulin: DNA-teknologiens første lægemiddel. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.