MÜELLER HINTON AGAR: BASIS, FORBEREDELSE OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den Mueller Hinton agar ikke er selektiv, fast næringsmedium består af kød infusion, pepton syrekasein, stivelse, agar og destilleret vand. Dette medium tillader fremragende mikrobiel vækst for de fleste hurtigtvoksende bakterier.

Det blev oprindeligt oprettet af John Howard Müeller og Jane Hinton for at isolere ernæringsmæssigt krævende bakterier som Neisseria gonorrhoeae og Neisseria meningitidis. På grund af dens egenskaber viste det sig imidlertid at være ideel til undersøgelse af følsomhed over for antibiotika, hvilket gav pålidelige og reproducerbare resultater.

Antibiogrammer (Müeller Hinton-agar). Kilde: Dr Graham Beards på en.wikipedia

Derfor er Müeller Hinton Agar det kulturmedium, der er accepteret af Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) og Det Europæiske Udvalg for Antimikrobiel Modtagelighedstest til udførelse af den antimikrobielle følsomhedstest ved Kirby-diskspredningsmetoden og Bauer.

Basis

Som et ikke-selektivt næringsmedium er det fremragende til vækst af de fleste patogene bakterier.

På den anden side gør dens enkle sammensætning, at stofferne let diffunderer på det, idet de er et væsentligt kendetegn for følsomhedstesten ved hjælp af diskdiffusionsmetoden.

Et andet af dets egenskaber er, at det indeholder en lav mængde af hæmmere, som tillader, at sulfonamider, trimethoprim og tetracycliner evalueres effektivt.

Det skal dog huskes, at mediet skal opfylde visse betingelser for at sikre, at det fungerer korrekt, herunder:

Justering af pH, dybden af ​​agaren og den passende koncentration af thymin, thymidin, Ca ⁺⁺, Mg ⁺⁺ og Zn ⁺⁺.

Du skal også vide, at metodikken er standardiseret, og at alle parametre derfor skal overholdes, såsom:

Inokulumkoncentrationen, koncentrationen og konserveringen af ​​antibiotiske diske, placeringen af ​​det passende antal diske på agaren, afstanden mellem en disk og en anden, den strategiske placering af visse antibiotika, atmosfæren, temperaturen og tiden for inkubation.

Forberedelse

Afvej 37 g dehydreret Müeller Hinton-medium og opløst i 1 liter destilleret vand. Opvarm mediet under omrøring for at hjælpe med opløsningen. Kog i 1 minut.

Autoklaver til sterilisering ved 121 ° C i 15 minutter. Ved fjernelse fra autoklaven skal kolben anbringes i et vandbad ved 50 ° C for at afkøle. Hæld 25 til 30 ml i sterile petriskåle med 10 cm diameter.

Pladerne skal have en gennemsnitlig tykkelse på 4 mm (ideel), idet et område på 3-5 mm er tilladt.

Hvis det ønskes at fremstille blodagar under anvendelse af Müeller Hinton-agar som base, hældes 5% sterilt og defibrineret lammeblod inden servering på pladerne.

Mediets endelige pH skal være mellem 7,2 og 7,4.

Invester og opbevar i køleskab, indtil brug. Lad pladen komme til stuetemperatur inden brug.

Farven på det forberedte medium er lys beige.

Applikationer

Det bruges til at udføre antibiogram eller antibiotisk følsomhedstest for de fleste hurtigvoksende ikke-krævende patogener.

Hvis agaren suppleres med blod, bruges den til at udføre antiogrammet af krævende mikroorganismer, såsom: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, blandt andre. Det er også blevet brugt til at isolere Legionella pneumophila.

Antibiogram teknik

Før der udføres antibiogrammet, skal der fremstilles en bakteriel opløsning svarende til 1,5 x ¹⁰⁸ celler.

Til dette tages og suspenderes 3 til 4 kolonier af den rene kultur i en sojabønne trypticase-bouillon eller i Müeller Hinton-bouillon, inkuberes i 2 til 6 timer, og koncentrationen justeres med sterilt saltvand, sammenlignes det med en Mac Farland-standard på 0,5%.

Hvis de kræver mikroorganismer, kan kolonier suspenderes direkte op til en koncentration på 0,5% Mac Farland. Derefter podes Müeller Hinton-pladen med en vatpind imprægneret med den tilberedte bakterieopløsning.

For at gøre dette nedsænkes vatpinden i opløsningen, og derefter fjernes overskydende væske ved at trykke mod rørets vægge. Umiddelbart bagefter føres pinden over hele overfladen og efterlader ingen steder uberørt, derefter drejes pladen let, og den podes igen. Handlingen gentages yderligere to gange.

Lad stå i 10 minutter, og indsæt derefter antibiotikaskiverne med en steril tang, hvorved der er et mellemrum på 24 mm. Når du har placeret hver disk på agaren, skal du trykke let på hver disk med pincetten for at sikre, at de klæber godt.

Når processen er afsluttet, vendes pladen og inkuberes ved 35-37 ° C i aerobiose i 16 til 18 timer. Hvis det er en krævende mikroorganisme, kan den fortjener mikroaerofili, og hvis antibiogrammet indeholder oxacillinskiver, skal det læses efter 24 timer.

En lineal bruges til at måle diameteren på hver glorie. Resultaterne skal registreres i mm. Derefter korreleres de opnåede værdier med tabellerne over afskæringspunkter, der er offentliggjort i den aktuelle CLSI-manual.

Måling af inhiberingshalogen. Kilde: USCDCP, Pixnio.com

Rapporter som følsom (S), mellemliggende (I) eller modstandsdygtig (R), som tilfældet er.

Antibiotika vælges i henhold til den isolerede mikroorganisme og den infektionstype, den producerer.

Nogle gange skal man huske den strategiske placering af antibiotika for at afsløre fænotypiske resistensmønstre.

Strategisk pladeplacering på Müeller Hinton-agar

For enterobakterier skal clavulansyreskiven placeres mod 3. og 4. generation af cephalosporiner. En ægformet udvidelse indikerer, at stammen er en producent af beta-laktamaser med udstrakt spektrum (ESBL). Dette betyder, at patienten ikke bør behandles med cephalosporiner.

Fenotypisk ekspression af beta-lactamase (ESBL) -produktion med udstrakt spektrum i en Escherichia coli-stamme. Kilde: Foto taget af forfatteren MSc. Marielsa gil

I Staphylococcus er det vigtigt at placere erythromycin eller azithromycin-disken foran clindamycin-disken (D-test).

En resistent halo i erythromycin og en udfladning i clindamycin-halogen indikerer, at stammen besidder stammeinducerbar clindamycinresistens (ICR). Dette betyder, at en clindamycin-behandling ikke vil være effektiv.

For at søge efter inducerbare AMP C-stammer i Enterobacteriaceae og nogle ikke-fermenterende Gram-negative stænger, står tazobactan ceftazidime, cefoxitin eller piperacillin-skiver mod en imipenem-skive i en afstand af 27 mm.

En udfladet glorie på en af ​​diske mod imipenem indikerer tilstedeværelsen af ​​inducerbar AMP C.

Til søgning efter konstitutiv C-AMP står en 500 ug cloxacillin-disk over for ceftazidim (30 ug) og med cefotaxim (30 ug) i en afstand af 25 mm. En udvidet glorie i en hvilken som helst af cephalosporinerne indikerer positivitet.

Cloxacillin-disken kan også erstattes med en 9 mm skive af Whatman nr. 6-filterpapir, der er imprægneret med phenylborinsyre (400 ug) med en afstand på 18 mm. Det fortolkes det samme som det foregående.

Til slut anvendes til at undersøge produktionen af ​​metallobetalactamaser især i Pseudomonas aeruginosa, en disk, der er imprægneret med 10 µl ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA 750 µg) og thioglycolic syre (SMA 300 µg), der konfronteres med imipenem- og meropenem-skiverne, i en afstand af 15 mm.

Testen er positiv, hvis der er en udvidelse af imipenem- eller meropenem-haloer mod EDTA / SMA-disken. Dette resultat skal bekræftes ved den ændrede Hodge-test.

Denne metode består af inokulering af en Escherichia coli ATCC 25922-stamme på Müeller Hinton-pladen. En imipenem-disk anbringes i midten af ​​pladen, og derefter laves en stribe fra disken til periferien med den mistænkte P. aeruginosa-stamme. Op til 4 stammer kan testes pr. Plade.

Testen vil være positiv, hvis der er en zone med forvrængning af imipenem-glorie omkring strækmærket.

Årsager til fejlagtige resultater

- Dårligt konserverede antibiotiske diske kan give falsk resistens. For eksempel er oxacillindisken meget sårbar over for temperaturændringer.

-En pH-værdi for mediet under det angivne (sure) producerer mindre glorier i aminoglycosider og makrolider (risiko for falsk resistens) og større glorier i penicillin, tetracyclin og novobiocin (risiko for falsk følsomhed).

-Hvis pH er over det, der er angivet (alkalisk), er virkningerne beskrevet ovenfor vendt.

-Media med høje thymin- og thymidinkoncentrationer har en indflydelse ved markant at reducere inhiberingshalogenerne for sulfonamider og trimethoprim.

-Høje koncentrationer af calcium og magnesium producerer falsk resistens af aminoglycosider, polymyxin B og tetracycliner mod stammer af Pseudomonas aeruginosa.

-Lave koncentrationer af calcium og magnesium producerer falske følsomheder af aminoglycosider, polymyxin B og tetracycliner mod stammer af Pseudomonas aeruginosa.

-Tilstedeværelsen af ​​zink påvirker resultaterne af carbapenem-diske (imipenem, meropenem og ertapenem).

-Tykkelse af mediet under 3 mm giver falske følsomhedsresultater, medens tykkelse over 5 giver falsk modstand.

-Mobiliseringen af ​​diske i antibiogrammet giver deformerede glorier, da afgivelsen af ​​antibiotika er øjeblikkelig.

- Meget svage inokuleringer påvirker resultaterne, da der ikke vil være en ensartet eller sammenflydende vækst i agaren, en nødvendig betingelse for at kunne måle inhiberingshaloer, ud over det faktum, at glorerne kan give større end normalt.

-Overladet inokler kan give glorier mindre end normalt.

-Ikke at respektere afstanden mellem diske får en halo til at overlappe hinanden og de kan ikke læses korrekt.

-Inkuber med CO ₂ øger størrelsen på halogenerne på tetracyclin- og methicillin-skiverne.

-Inkuber ved temperaturer under 35 ° C producerer større glorier.

-Tilsætningen af ​​blod reducerer størrelsen på sulfa-halogen.

Begrænsning

Følsomheden af ​​et antibiotikum påvist i antiogrammet mod en mikroorganisme (in vitro) er ikke en garanti for, at det fungerer in vivo.

QA

For at vide, om mediet indeholder en tilstrækkelig mængde thymin, skal en stamme af Enterococcus faecalis ATCC 29212 plantes og følsomheden testes for trimethoprim sulfamethoxazol (SXT), det skal give en glorie, der er lig med eller> 20 mm for at være tilfredsstillende.

Referencer

1. "Müller-Hinton-agar." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 16 nov. 2018, 12:23 UTC. 27. januar 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Betingelser for en god følsomhedsundersøgelse ved agardiffusionstest. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratory. Müeller Hinton-agar med 5% fåreblod. 2009. Tilgængelig på:
5. BD Müeller Hinton II Agar Laboratory. 2017. Tilgængelig på:.bd.com
6. Britannia Laboratories. Müeller Hinton-agar. 2015. Tilgængelig på: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. betalaktamaser af AmpC-type: Generaliteter og metoder til fænotypisk detektion. Præsten Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Fås på: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fænotypisk detektion af metallobetalactamaser i kliniske isolater af Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Fås på: scielo.org.