ENDONUKLEASER: FUNKTIONER, TYPER OG EKSEMPLER - BIOLOGI - 2025

De endonukleaser er enzymer, der skærer phosphodiesterbindingerne beliggende inden nucleotidkæden. Endonukleasebegrænsningssteder er meget forskellige. Nogle af disse enzymer skærer DNA (deoxyribonukleinsyre, vores genetiske materiale) næsten overalt, dvs. de er ikke-specifikke.

I modsætning hertil er der en anden gruppe af endonukleaser, der er meget specifikke i regionen eller sekvensen, der skal spaltes. Denne gruppe enzymer er kendt som restriktionsenzymer, og de er meget nyttige i molekylærbiologi. I denne gruppe har vi de velkendte enzymer Bam HI, Eco RI og Alu I.

Endonukleaser skærer DNA internt.

Kilde: pixabay.com

I modsætning til endonukleaser er der en anden type katalytiske proteiner - exonukleaser - som er ansvarlige for at bryde phosphodiesterbindingerne i slutningen af ​​kæden.

Begrænsning endonukleaser

Restriktionsendonukleaser eller restriktionsenzymer er katalytiske proteiner, der er ansvarlige for spaltning af phosphodiesterbindingerne inde i DNA-kæden i meget specifikke sekvenser.

Disse enzymer kan købes fra flere bioteknologiselskaber, og deres anvendelse er næsten væsentlig inden for aktuelle DNA-manipulationsteknikker.

Restonstrationsendonukleaser benævnes ved hjælp af de første bogstaver i det binomiale videnskabelige navn på den organisme, hvorfra de kom, efterfulgt af stammen (dette er valgfrit) og slutter med gruppen af ​​restriktionsenzymer, som de hører til. For eksempel er BamHI og EcoRI meget anvendte endonukleaser.

Regionen af ​​DNA, som enzymet genkender, kaldes restriktionsstedet og er unikt for hver endonuklease, selvom adskillige enzymer kan falde sammen på restriktionsstederne. Dette sted består generelt af en kort palindrom sekvens, der er ca. 4 til 6 basepar i længden, såsom AGCT (for Alu I) og GAATTC for Eco RI.

Palindromiske sekvenser er sekvenser, som, selvom de læses i retningen 5 'til 3' eller 3 'til 5', er identiske. For eksempel, når det gælder Eco RI, er den palindromiske sekvens: GAATTC og CTTAAG.

Funktioner og anvendelser af restriktionsendonukler

Heldigvis for molekylærbiologer har bakterier udviklet en række restriktionsendonukleaser i løbet af udviklingen, som internt fragmenterer genetisk materiale.

I naturen har disse enzymer udviklet sig - formodentlig - som et bakterielt beskyttelsessystem mod invasion af fremmede DNA-molekyler, såsom dem fra fager.

For at skelne mellem nativt og fremmed genetisk materiale kan disse restriktionsendonukleaser genkende specifikke nukleotidsekvenser. DNA, der ikke har denne sekvens, kan således forstyrres inde i bakterien.

I modsætning hertil, når endonukleasen genkender restriktionsstedet, binder den sig til DNA'et og skærer det.

Biologer er interesseret i at studere det genetiske materiale i levende ting. DNA består dog af flere millioner basepar i længden. Disse molekyler er ekstremt lange og skal analyseres i små fragmenter.

For at nå dette mål integreres restriktionsendonukleaser i forskellige molekylærbiologiske protokoller. For eksempel kan et individuelt gen indfanges og replikeres til fremtidig analyse. Denne proces kaldes "kloning" af et gen.

Restriktionsfragmentlængdepolymorfisme (RFLP)

Polymorfismer med restriktionsfragmentlængde henviser til mønsteret af specifikke nukleotidsekvenser i DNA, som restriktionsendonukleaser er i stand til at genkende og skære.

Takket være enzymernes specificitet er hver organisme kendetegnet ved et specifikt skæremønster i DNA'et med oprindelse i fragmenter med variabel længde.

Typer af restriktionsendonukleaser

Historisk set er restriktionsendonukleaser klassificeret i tre typer enzymer, betegnet med romertal. For nylig er en fjerde type endonuklease beskrevet.

Type I

Det vigtigste træk ved endonukleaser af type I er, at de er proteiner, der består af flere underenheder. Hver af disse fungerer som et enkelt proteinkompleks og har normalt to underenheder kaldet R, to M og en S.

S-delen er ansvarlig for genkendelsen af ​​restriktionsstedet i DNA. R-underenheden er på sin side essentiel for spaltning, og M er ansvarlig for katalysering af methyleringsreaktionen.

Der er fire underkategorier af type I-enzymer, kendt med bogstaverne A, B, C og D, der er i almindelig brug. Denne klassificering er baseret på genetisk komplementering.

Type I-enzymer var de første restriktionsendonukleaser, der blev opdaget og oprenset. Imidlertid er den mest anvendelige inden for molekylærbiologi type II, som vil blive beskrevet i det næste afsnit.

Type II

Endonukleaser af type II-restriktion genkender specifikke DNA-sekvenser og spaltning i en konstant position tæt på en sekvens, der producerer 5 'phosphater og 3' hydroxyler. De kræver generelt magnesiumioner (Mg ²⁺) som cofaktorer, men der er nogle, der har meget mere specifikke krav.

Strukturelt kan de vises som monomerer, dimere eller endda tetramere. Rekombinant teknologi bruger type II endonukleaser, og af denne grund er mere end 3.500 enzymer blevet karakteriseret.

Type III

Disse enzymatiske systemer er sammensat af to gener, kaldet mod og res, som koder for underenhederne, der genkender DNA og til modifikationer eller begrænsninger. Begge underenheder er nødvendige for begrænsning, en proces, der er helt afhængig af ATP-hydrolyse.

For at spalte DNA-molekylet skal enzymet interagere med to kopier af den ikke-palindromiske genkendelsessekvens, og stederne skal være i en omvendt orientering på underlaget. Spaltning foregår med en DNA-translokation.

Type IV

En yderligere gruppe er identificeret for nylig. Systemet er sammensat af to eller flere gener, der koder for proteiner, der kun spalter modificerede DNA-sekvenser, enten methyleret, hydroxymethyleret eller hydromethyleret glucosyl.

F.eks. Genkender enzymet EckKMcrBC to dinucleotider med den generelle form RmC; en purin efterfulgt af et methyleret cytosin, som kan adskilles med flere basepar - fra 40 til næsten 3000. Spaltning finder sted ca. 30 basepar efter det sted, som enzymet genkender.

Endonukleaser type V

Endonukleaser af denne type er også kendt som "homing" endonukleaser. Disse enzymer genkender og skærer mål-DNA-sekvensen på unikke steder i genomet fra 14 til 40 bp.

Disse enzymer kodes ofte i introner, og deres funktion antages at være at fremme vandret overførsel af afskårne sekvenser. Efter opskæring forekommer en brudreparation i den dobbelte DNA-helix baseret på den komplementære sekvens.

eksempler

Endonuclease I fra E. coli fungerer som et forsvarssystem mod fag og parasitter. Det er hovedsageligt placeret mellem den cytoplasmatiske membran og cellevæggen. Det producerer dobbeltstrengede pauser i det fremmede DNA, som det interagerer med i det periplasmatiske rum.

CRISPR-Cas endonukleaser er enzymer, der virker på forsvarsmekanismen for mange typer bakterier. Disse identificerer og skærer specifikke DNA-sekvenser fra invaderende organismer, som generelt er vira.

For nylig opdagede forskere ved Massachusetts Institute of Technology (MIT) CRISPR-Cas12bm genomredigeringssystem med høj præcision til ændring af humane celler.

Referencer

1. Burrell, MM (red.). (1993). Enzymer af molekylærbiologi. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Type I-restriktionsenzymer og deres pårørende. Nucleinsyreforskning, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS, & Pfaller, MA (2017). Medicinsk mikrobiologi + StudentConsult på spansk + StudentConsult. Elsevier Sundhedsvidenskab.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriktionsendonukleaser i analyse og omstrukturering af DNA-molekyler. Årlig gennemgang af biokemi, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Type II-restriktionsendonukleaser: struktur og mekanisme. Cellulære og molekylære biovidenskaber, 62 (6), 685.