RESTRIKTIONSENZYMER: FUNKTIONER, TYPER OG EKSEMPLER - BIOLOGI - 2025

De restriktionsenzymer er endonukleaser ansat af visse archaea og bakterier til at inhibere eller "begrænse" spredning af virus inde. De er især almindelige i bakterier og er en del af deres forsvarssystem mod fremmed DNA kaldet restriktion / modifikationssystem.

Disse enzymer katalyserer spaltningen af ​​dobbeltbånd-DNA på specifikke steder, reproducerbart og uden brug af yderligere energi. De fleste kræver tilstedeværelse af cofaktorer, såsom magnesium eller andre divalente kationer, skønt nogle også kræver ATP eller S-adenosylmethionin.

HindIII-restriktionsenzymreaktionsskema (Kilde: Helixitta via Wikimedia Commons)

Endonukleaser til restriktioner blev opdaget i 1978 af Daniel Nathans, Arber Werner og Hamilton Smith, der modtog Nobelprisen i medicin for deres opdagelse. Deres navn stammer generelt fra organismen, hvor de først blev observeret.

Sådanne enzymer er vidt brugt i udviklingen af ​​DNA-kloningsmetoder og andre molekylærbiologiske og gentekniske strategier. Deres specifikke sekvensgenkendelsesegenskaber og evnen til at skære sekvenser tæt på genkendelsessteder gør dem til magtfulde værktøjer i genetisk eksperimentering.

Fragmenter genereret af restriktionsenzymer, der har virket på et bestemt DNA-molekyle, kan bruges til at genskabe et "kort" af det originale molekyle ved at bruge information om de steder, hvor enzymet skærer DNA.

Nogle restriktionsenzymer kan have det samme genkendelsessted på DNA, men de skærer ikke nødvendigvis det på samme måde. Der er således enzymer, der skærer, der forlader stumpe ender, og enzymer, der skærer forlader kohæsive ender, som har forskellige anvendelser inden for molekylærbiologi.

I øjeblikket er der hundreder af forskellige kommercielt tilgængelige restriktionsenzymer, der tilbydes af forskellige kommercielle huse; Disse enzymer fungerer som "brugerdefinerede" molekylsaks til forskellige formål.

Funktioner

Restriktionsenzymer udfylder den modsatte funktion af polymeraser, da de hydrolyserer eller bryder esterbindingen inden for phosphodiesterbindingen mellem tilstødende nukleotider i en nukleotidkæde.

I molekylærbiologi og genteknologi er de vidt anvendte værktøjer til konstruktion af ekspressions- og kloningsvektorer såvel som til identifikation af specifikke sekvenser. De er også nyttige til konstruktion af rekombinante genomer og har et stort bioteknologisk potentiale.

De nylige fremskridt inden for genterapi gør den aktuelle brug af restriktionsenzymer til introduktion af bestemte gener i vektorer, der er køretøjer til transport af sådanne gener i levende celler, og som sandsynligvis har evnen til at indsætte i det cellulære genom til at udføre permanente ændringer.

Handlingsmekanisme

Restriktionsenzymer kan katalysere dobbeltbåndets DNA-spaltning, selvom nogle er i stand til at genkende enkeltbåndets DNA-sekvenser og endda RNA. Skæring sker efter genkendelse af sekvenserne.

Virkningsmekanismen består af hydrolyse af phosphodiesterbindingen mellem en phosphatgruppe og en deoxyribose i skeletet af hver DNA-streng. Mange af enzymerne er i stand til at skære på det samme sted, som de genkender, mens andre skærer mellem 5 og 9 basepar før eller efter det.

Normalt skæres disse enzymer ved 5'-enden af ​​phosphatgruppen, hvilket giver anledning til DNA-fragmenter med en 5'-phosphoryl-ende og en 3'-terminal hydroxylende.

Da proteiner ikke kommer i direkte kontakt med genkendelsesstedet i DNA, skal de omplaceres successivt, indtil det specifikke sted er opnået, måske ved hjælp af "glidende" mekanismer på DNA-strengen.

Under enzymatisk spaltning placeres phosphodiesterbindingen i hver af DNA-strengene inden for et af de aktive steder med restriktionsenzymer. Når enzymet forlader genkendelses- og spaltningsstedet, gør det det gennem ikke-specifikke forbigående forbindelser.

typer

Fem kendte restriktionsenzymer er i øjeblikket. Her er en kort beskrivelse af hver enkelt:

Type I-restriktionsenzymer

Disse enzymer er store pentamerproteiner med tre underenheder, en til restriktion, en til methylering og en til sekvensgenkendelse i DNA. Disse endonukleaser er multifunktionelle proteiner, der er i stand til at katalysere restriktions- og modificeringsreaktioner, de har ATPase-aktivitet og også DNA-topoisomerase.

Enzymer af denne type var de første endonukleaser, der blev opdaget, de blev først renset i 1960'erne og er blevet undersøgt i stor dybde lige siden.

Type I-enzymer anvendes ikke i vid udstrækning som et bioteknologisk værktøj, da spaltningsstedet kan være i en variabel afstand på op til 1.000 basepar fra genkendelsesstedet, hvilket gør dem upålidelige med hensyn til eksperimentel reproducerbarhed.

Type II-restriktionsenzymer

De er enzymer sammensat af homodimerer eller tetramere, der skærer DNA på definerede steder mellem 4 og 8 bp i længden. Disse spaltningssteder er typisk palindromiske, dvs. de genkender sekvenser, der læses på samme måde i begge retninger.

Mange af type II-restriktionsenzymer i bakterier skærer DNA, når de genkender dets fremmede karakter, da det ikke har de typiske modifikationer, som dens eget DNA skal have.

Dette er de enkleste restriktionsenzymer, da de ikke kræver nogen cofactor bortset fra magnesium (Mg +) for at genkende og skære DNA-sekvenser.

Præcisionen af ​​type II-restriktionsenzymer ved genkendelse og skæring af enkle sekvenser i DNA i præcise positioner gør dem til en af ​​de mest anvendte og uundværlige i de fleste grene af molekylærbiologi.

I gruppen af ​​type II-restriktionsenzymer er der flere underklasser klassificeret efter bestemte egenskaber, der er unikke for hver enkelt. Klassificeringen af ​​disse enzymer udføres ved at tilføje bogstaver i alfabetet, fra A til Z efter navnet på enzymet.

Nogle af de underklasser, der bedst er kendt for deres anvendelighed, er:

Underklasse IIA

De er dimerer af forskellige underenheder. De genkender asymmetriske sekvenser og bruges som ideelle forstadier til frembringelse af skæreenzymer.

Underklasse IIB

De består af en eller flere dimerer og skærer DNA på begge sider af genkendelsessekvensen. De skar begge DNA-strenge et basepar-interval foran genkendelsesstedet.

Underklasse IIC

Enzymer af denne type er polypeptider med opdelingsfunktioner og modifikation af DNA-strenge. Disse enzymer skærer begge strenge asymmetrisk.

Underklasse IIE

Enzymerne i denne underklasse er de mest anvendte i genteknologi. De har et katalytisk sted og kræver generelt en allosterisk effektor. Disse enzymer er nødt til at interagere med to kopier af deres genkendelsessekvens for at udføre effektiv spaltning. Inden for denne underklasse findes enzymerne EcoRII og EcoRI.

Type III restriktionsenzymer

Endonukleaser af type III-restriktion består af kun to underenheder, den ene er ansvarlig for DNA-genkendelse og -modifikation, mens den anden er ansvarlig for sekvensspaltning.

Disse enzymer kræver to cofaktorer for deres funktion: ATP og magnesium. Restriktionsenzymer af denne type besidder to asymmetriske genkendelsessteder, translokerer DNA på en ATP-afhængig måde og skærer det mellem 20-30 bp ved siden af ​​genkendelsesstedet.

Type IV-restriktionsenzymer

Type IV-enzymer er lette at identificere, da de skærer DNA med methyleringsmærker, de består af flere forskellige underenheder, der er ansvarlige for at genkende og skære DNA-sekvensen. Disse enzymer bruger GTP og divalent magnesium som cofaktorer.

Specifikke spaltningssteder inkluderer nukleotidstrenge med methylerede eller hydroxymethylerede cytosinrester på en eller begge strenge af nukleinsyrer.

Type V-restriktionsenzymer

Denne klassificering grupperer CRISPER-Cas-enzymerne, som identificerer og skærer specifikke DNA-sekvenser fra invaderende organismer. Cas-enzymer bruger en streng CRISPER-syntetiseret guide-RNA til at genkende og angribe invaderende organismer.

Enzymer klassificeret som type V er polypeptider struktureret efter type I, II og II enzymer. De kan skære sektioner af DNA fra næsten enhver organisme og med en lang rækkevidde. Deres fleksibilitet og brugervenlighed gør disse enzymer til et af de mest anvendte redskaber i genteknologi i dag sammen med type II-enzymer.

eksempler

Restriktionsenzymer er blevet anvendt til påvisning af DNA-polymorfismer, især i populationsgenetiske undersøgelser og evolutionære undersøgelser under anvendelse af mitokondrielt DNA, for at opnå information om hastigheden af ​​nukleotidsubstitutioner.

I øjeblikket besidder vektorerne, der anvendes til transformation af bakterier til forskellige formål, multikloningssteder, hvor genkendelsessteder for flere restriktionsenzymer findes.

Blandt disse enzymer er de mest populære EcoRI, II, III, IV og V, opnået og beskrevet for første gang fra E. coli; HindIII fra H. influenzae og BamHI fra B. amyloliquefaciens.

Referencer

1. Bickle, TA, & Kruger, DH (1993). Biologi for DNA-begrænsning. Mikrobiologiske anmeldelser, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR Giver erhvervet resistens mod vira i prokaryoter. Science, 315 (marts), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). Det molekylære perspektiv: Begrænsning endonukleaser. Stamceller Fundamentals of Cancer Medicine, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Hoppe, hoppe og sløjfe ved hjælp af restriktionsenzymer. Biokemiske samfundstransaktioner, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Opretholdelse af artsidentitet og kontrol af bakteriespecifikation: en ny funktion til restriktions- / modifikationssystemer? Gen, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewins Gen XII (12 udg.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… She, Q. (2015). Udnyttelse af type I og Type III CRISPR-Cas systemer til genomredigering. Nucleic Acids Research, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Type I-restriktionsenzymer og deres pårørende. Nucleic Acids Research, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriktion Endonukleaser i analyse og omstrukturering af DNA-molekyler. Annu. Præsten Biochem., 273–293.
10. Nei, M., & Tajima, F. (1981). Dna-polymorfisme detekteres ved restriktionsendonukleaser. Genetik, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Cellular and Molecular Life Sciences Type II restriktion endonukleaser: struktur og mekanisme. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Hvordan restriktionsenzymer blev arbejdsheste i molekylærbiologi. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ, & Murray, K. (1976). Begrænsning endonukleaser. Kritiske anmeldelser i biokemi, (november), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Homing endonuclease struktur og funktion. Kvartalsvise anmeldelser af biofysik, 1–47.
15. Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Begrænsningens og antibegrænsningens biologi. Aktuel udtalelse i mikrobiologi, 8, 466–472.
16. Wilson, GG, & Murray, NE (1991). Systemer til begrænsning og ændring. Annu. Præsten Genet. 25, 585-627.
17. Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomisk indsigt i Campylobacter jejuni virulens og populationsgenetik. Infec. Dis. Oversat. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Struktur og mekanisme af multifunktionelle restriktionsendonukleaser. Annu. Præsten Biochem. 50, 285-315.