PROTEINASE K: KARAKTERISTIKA, ENZYMATISK AKTIVITET, ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den K proteinase er et enzym, der tilhører gruppen af serinproteaser, dvs. den er i midten en katalytisk aktiv aminosyren serin og har den funktion at bryde peptidbindingerne ved hydrolyse. Til gengæld hører dette enzym til familien af ​​subtilisinproteiner (peptidase S8).

Proteinase K har en molekylvægt (MW) på 28.900 dalton og blev isoleret for første gang i 1974 i ekstrakter af svampen Engyodontium album, tidligere kendt som Tritirachium album Limber.

Molekylstruktur af proteinase K. Kilde: Lykchiniadis

Det har en høj proteolytisk kapacitet, demonstreret ved at være i stand til at nedbryde det keratin, der findes i håret. Ordet keratin på engelsk er stavet "keratin", derfor er det blevet kaldt "proteinase K".

På grund af sin høje styrke til at spalte naturlige proteiner er dette enzym nyttigt i forskellige molekylærbiologiske teknikker. Det bruges primært til at isolere og fremstille nukleinsyrer med høj molekylvægt (MW).

Proteinase K virker ved at frigive nuklear DNA, mens proteiner ødelægges og inaktiveres RNaser og DNaser, det vil sige, det eliminerer nukleaser i DNA- og RNA-præparater.

På den anden side har det set, at proteinase K kan hydrolysere nogle denaturerede naturlige proteiner, hvilket har vakt forskernes interesse for dets anvendelse i studiet af prionproteiner (PrPC).

På trods af deres høje proteolytiske styrke er der proteiner, der er resistente over for virkningen af ​​proteinase K. Blandt dem er nogle unormale proteiner kaldet prions (PrPSc), der er forbundet med transmissible spongiforme encephalopatier.

Proteinase K-egenskaber

Proteinase K har en tertiær struktur, der består af tre lag, med et syv-kædet ß-ark anbragt mellem to lag helixer. Da den hører til S8-familien af ​​peptidaser, er den kendetegnet ved at have en katalytisk triade på det aktive sted, hvis rækkefølge er (Asp, His og Ser), der adskiller dem fra andre familier af peptidaser.

Dette enzym fra gruppen af ​​serinproteaser er kendetegnet ved hydrolysering af peptidbindingerne tæt på den carboxyliske gruppe af alifatiske og aromatiske aminosyrer.

På den anden side er det i stand til at virke i nærværelse af visse ætsende stoffer, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), Tris-HCL og EDTA, der bruges til at hjælpe denaturering af proteiner, hvilket får dem til at miste deres oprindelige struktur.

Dette er et foreløbigt trin i forberedelse af proteiner til elektroforeseteknikken. PH-området, hvor proteinase K virker, er ret bredt (2,0 til 12,0) med en optimal pH mellem 7,5 og 12,0, og dets isoelektriske punkt er 8,9. Som det kan ses, er det aktivt mod et meget bredt pH-område.

En anden egenskab, der skiller sig ud i proteinase K, er dens stabilitet i nærvær af høje temperaturer (50 - 60 ° C).

Enzymatisk aktivitet

Proteinase K kræver tilstedeværelse af calciumion, skønt dette ikke påvirker dens aktivitet, hvis det er vigtigt for at opretholde sin stabilitet.

For at proteinase K kan fordøje underlaget fuldstændigt, er en kontakttid på cirka 5 minutter til 2 timer nødvendig.

I denne forstand sammenlignede Daza et al. Imidlertid renheden af ​​det DNA, der blev opnået ved forskellige eksponeringstider mod proteinase K, og konkluderede, at en langvarig inkubation (op til 24 timer) markant forbedrer DNA'ets kvalitet.

I forhold til koncentrationen af ​​proteinase K-enzymet anvendt i de forskellige protokoller kan det imidlertid siges, at det er meget varieret.

Det kan bruges fra meget lave koncentrationer (5 µg / ml) til koncentrationer på 500 µg / ml. Men de mest almindelige arbejdskoncentrationer spænder fra 50 til 100μg / ml, især til proteinfordøjelse og nukleaseinaktivering. Selvom der kræves en koncentration på 2 mg / ml til behandling af væv.

Applikationer

Dets anvendelser er meget brede og kan sammenfattes som følger:

-Det bruges til fordøjelse af proteiner og DNA-ekstraktion ved forskellige metoder, såsom: saltning, PK-SDS, cetyl-trimethylammoniumbromid (CTAB), modificeret kaliumacetat og ekstraktion med natriumiodid.

-Inaktivering af nukleaser (RNaser og DNaser).

-I hybridiseringsteknikken in situ (HIS) for at hjælpe med frigivelsen af ​​nukleinsyre ud over at eliminere uønskede proteiner.

-Modificering af proteiner.

- På forskningsniveau i forskellige undersøgelser.

Fordele ved proteinase K

Flere sammenlignende undersøgelser er blevet udført mellem DNA-ekstraktionsteknikker, der bruger Proteinase K, med andre, der ikke bruger det, og alle konkluderer, at der er større fordele ved anvendelse af enzymet. Fordelene inkluderer følgende:

-DNA opnås med høj molekylvægt, af høj kvalitet og renhed.

-Det ekstraherede DNA er stabilt i op til 3 måneder.

Det ekstraherede DNA kan anvendes i de følgende teknikker: Southern blot, polymerasekædereaktion (PCR), elektroforese, blandt andre.

Proteinase K-resistente proteiner

Forskellige undersøgelser har konkluderet, at prioner (unormale toksiske PrPSc-proteiner) adskiller sig fra PrPC (native) proteiner ved at være resistente over for virkningen af ​​proteinase K, mens PrPC'er er følsomme over for dens virkning.

Andre forfattere har beskrevet, at der i strukturen af ​​PrPSc er følsomme portioner og andre, der er resistente over for proteinase K. Imidlertid er begge dele lige så toksiske og infektiøse.

På den anden side isolerede Bastian et al. I 1987 4 proteiner på 28, 30, 66 og 76 kda fra en art af Spiroplasma mirum. Alle viste sig at være resistente over for virkningen af ​​proteinase K og havde også en krydsreaktion med nogle prioner.

Det er kendt, at denne art kan forårsage grå stær og vigtig neurologisk skade, og på grund af Bastians videnskabelige fund, blandt andre undersøgelser, er der gjort et forsøg på at forbinde denne mikroorganisme med transmissible spongiforme encephalopatier.

Etiologien af ​​denne degenerative neurologiske patologi tilskrives dog fortsat prioner i dag.

I denne forstand identificerede og karakteriserede Butler et al. I 1991 en klasse proteinresistent over for proteinase K på 40 kda fra to stammer af Mycoplasma hyorhinis. Denne patogen påvirker svin og inficerer deres væv, men i dette tilfælde var der ingen krydsreaktion med de testede prioner.

Der kræves mere forskning for at belyse mange ukendte i denne henseende.

Referencer

1. Bastian F, Jennings R og Gardner W. 1987. Antiserum til scrapie-associeret fibrilprotein krydsreagerer med Spiroplasma miru m fibril proteiner. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Evaluering af en DNA-ekstraktions- og oprensningsmetode fra formaldehyd-fikseret muskelvæv fra uidentificerede kadavre. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, og Mcgarrity G. Identifikation og karakterisering af K-resistente proteiner i proteiner i medlemmer af klassen Mollicutes. Infektion og immunitet, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Sammenligning af to Trypanosoma cruzi DNA-ekstraktionsprotokoller dyrket i aksenisk medium. Præsten Peru. Med. Exp. Public Health 2014; 31 (2): 222-227. Fås på: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E og Palma W. Bestemmelse af effektiviteten af ​​fem DNA-ekstraktionsprotokoller fra paraffiniseret materiale til molekylære undersøgelser. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.