CATALASE TEST: BEGRUNDELSE, TEKNIK OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den katalase test er en metode, der anvendes i bakteriologiske laboratorier at afsløre tilstedeværelsen af enzymet katalase i de bakterier, som besidder den. Sammen med Gram-pletten er de de vigtigste tests, der skal udføres på nyligt isolerede mikroorganismer. Disse tests guider mikrobiologen om de trin, der skal følges for den endelige identifikation af den pågældende mikroorganisme.

Generelt besidder bakterier, der indeholder cytochrom, enzymet katalase, hvilket betyder, at fakultative aerobe og anaerobe bakterier skal have den. Der er dog undtagelser, såsom Streptococcus, som til trods for at være ankultive anaerobe mikroorganismer ikke har enzymkatalasen.

Kørsel af Catalase Test viser en positiv reaktion. Kilde: Ingen maskinlæsbar forfatter leveret. Nase antaget (baseret på ophavsretskrav).

Derfor bruges katalasetesten primært til at skelne familierne Staphylococaceae og Micrococaceae (begge katalasepositive) fra familien Streptococaceae (negativ katalase).

Ligeledes adskilles slægten Bacillus (katalasepositiv) fra slægten Clostridium (katalase negativ) blandt andre.

Basis

Catalase er et enzym klassificeret som et hydroperoxidase betyder dette, at de bruger hydrogenperoxid (H ₂ O ₂) som substrat.

Det betragtes også som en oxidoreduktase, da der i reaktionen, hvor den deltager, er et element, der tjener som en elektrondonor (reducerende stof) og et andet som en elektronreceptor (oxiderende stof).

Catalase er et protein, der indeholder en proserisk gruppe med fire trivalente jernatomer (Fe ⁺⁺⁺), derfor er det et homoprotein. Ferriion forbliver oxideret under reaktionen.

Det kan siges, at katalase er et afgiftende enzym, da dets funktion er at eliminere stoffer, der produceres under bakteriemetabolisme, der er giftige for bakterier. Blandt disse stoffer er brintperoxid.

Brintperoxid dannes ved nedbrydning af sukkerarter aerobt. Denne proces forekommer som følger:

Superoxid ion (O ₂ ^-) (frit radikal) er udformet som slutproduktet af assimilering af glucose ved den aerobe rute. Dette er giftigt og elimineres af enzymet superoxid-dismutase, der omdanner det til gasformigt ilt og brintperoxid.

Brintperoxid er også giftigt for bakterier og skal fjernes. Enzymkatalasen nedbryder brintperoxid i vand og ilt.

Catalase kan virke på andre substrater end hydrogenperoxid, såsom alkoholer, aldehyder, syrer, aromatiske aminer og fenoler. Imidlertid kan hydrogenperoxid også anvendes ved katalase til at oxidere andre giftige forbindelser, såsom methyl og ethylalkohol.

Ligeledes er katalase til stede i fagocytiske celler, der beskytter den mod den giftige virkning af hydrogenperoxid.

Rutine teknik til Catalase Test

-Slide-metode

materialer

3% hydrogenperoxid (10 volumener).

Mikroskopglas

Engangsplastgreb eller træstænger.

Behandle

Tag nok af kolonien til at studere uden at røre ved den agar, den kom fra. Kolonien skal være frisk, det vil sige fra en kultur på 18 til 24 timer.

Placer koloni på den tørre objektglas og en dråbe på 3% hydrogenperoxid til det (30% H ₂ O ₂ kan også anvendes). Se med det samme, om der frigives bobler.

Tolkning

Positiv reaktion: gasudvikling, beviset ved dannelse af bobler (stærk boblende).

Negativ reaktion: ingen bobledannelse.

-Direkte metode i ren kultur

Sted 1 ml 3% H ₂ O ₂ på en ren plade eller kile kultur, der ikke indeholder blod (fortrinsvis næringsagar). Vær opmærksom på, om der umiddelbart er bobledannelse eller ej. 30% H ₂ O ₂ kan også anvendes.

Det tolkes på samme måde som porta-objektmetoden.

-Metode med kapillarrør eller Fung and Petrishko

Fyld et 67 mm kapillarrør til en højde af 20 mm med 3% brintperoxid efter kapillaritet.

Berøre isolerede koloni, der skal undersøges med kapillæren fyldt med 3% H ₂ O ₂ . Vær opmærksom på, hvis kapillæren fyldes med bobler på cirka 10 sekunder. Denne metode tillader semi-kvantificering af reaktionen i kryds:

Uden kryds er der ingen bobler (negativ reaktion).

+ ---- Få bobler (svag eller forsinket reaktion).

++ --– Rigelige bobler (moderat reaktion).

+++ - Bubbler når den modsatte ende (stærk reaktion).

-Taylor og Achanzar-metode til katalasetest, der giver tvivlsomhed

Placer en isoleret koloni på en ren, tør slide, og derefter placere en dråbe 0,5% H ₂ O ₂ og dække med et dækglas. Se, om der er dannelse af fangede bobler.

Fortolkning: tilstedeværelsen af ​​bobler indikerer en positiv reaktion. Ingen bobler, det fortolkes som en negativ reaktion.

Catalase test for Mycobacterium arter

Denne teknik skal udføres ved at kontrollere pH og temperatur. Det skal udføres under en laminar strømningshætte, da manipulationen af ​​de forskellige Mycobacterium-arter er farlig.

-materialer

Hydrogenperoxid 30% eller 110 volumener (superoxal).

Phosphatbuffer pH 7

10% mellem 80

Mycobacterium kilekultur i 3 til 4 uger

-Forberedelse

Phosphatbuffer pH 7

At veje:

1.361 g vandfrit monokaliumphosphat (KH ₂ PO ₄).

1,420 g vandfri dinatrium (Na2HPO3) phosphat.

Opløs begge salte i lidt sterilt destilleret vand og fyld op til 1000 ml med vand.

10% mellem 80

Foretag en fortynding på 1:10 til Tween 80, der er kommercielt koncentreret, for at gøre dette, fortsæt som følger:

Tag 1 ml Tween 80, og anbring det i lidt destilleret vand, opløs og fyld derefter op med volumen til 10 ml.

Endelig reagens

Bland en mængde phosphatbuffer med en mængde på 10% Tween 80 (lige dele). Definer i laboratoriet, hvor meget du vil forberede.

-Behandle

Anbring 5 ml phosphatbuffer i et sterilt, skruetrækket reagensglas (Bakelite).

Med en inokulationssløjfe skal du tage nok koloni af en Mycobacterium-vækst podet i kiler og opløses i fosfatbufferen.

Hætt røret uden at stramme tråden for meget. Anbring i et vandbad ved 68 ° C i 20 til 30 minutter. Tag ud og lad det afkøle til 22-25 ° C

Mål 0,5 ml af det endelige reagens (bland) og tilsæt det til røret med den kolde opløsning. Observer dannelsen eller ej af bobler.

Det fortolkes på samme måde som de tidligere teknikker.

Brug

Når der opnås kolonievækst i beriget medie, skal der udføres en Gram-farve og en katalasetest på de opnåede kolonier. Dette vil guide mikrobiologen om de procedurer, der skal følges for endelig identifikation.

Kilde: Udarbejdet af forfatteren MSc. Marielsa gil

QA

For at evaluere den gode præstation af hydrogenperoxidreagenset skal du bruge frisk dyrkede kontrolstammer, såsom Staphylococcus aureus som en positiv kontrol og Streptococcus sp-stammer som en negativ kontrol.

Et andet alternativ, der tjener som en positiv kontrol, er at anbringe en dråbe hydrogenperoxid på blodagaren, erytrocytterne har katalase, derfor vil der være en bobling, hvis reagenset er i god stand.

En chokoladeagar kan bruges som en negativ kontrol, her er erytrocytterne allerede lyseret, og testen er negativ.

Begrænsninger

-Brug ikke gamle kulturer til testen, da dette kan forårsage falske negativer.

- Undgå at tage kolonier fra kulturer på blodagar, hvis du er forsigtig med ikke at røre agar; Denne procedure kan føre til falske positiver, da røde blodlegemer indeholder katalase.

-Hvis du tager kolonien med et platinahåndtag, skal du ikke vende procedurens rækkefølge, fordi dette kan skabe falske positiver. Dette skyldes, at platin er i stand til at reagere med brintperoxid og forårsage en bobling.

-Brug ikke hydrogenperoxidreagens, hvis det er meget gammelt, da reagenset er meget ustabilt og har en tendens til at nedbrydes over tid.

-Hold brintperoxidreagens beskyttet mod lys og nedkølet for at forhindre skader.

- Udfør en kvalitetskontrol af hydrogenperoxidreagenset, hver gang det bruges.

-Tag hensyn til, at hvis 30% H ₂ O ₂ anvendes, reaktionerne er stærkere end dem udført med 3% H ₂ O ₂.

Referencer

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Biokemiske test til identifikation af bakterier af klinisk betydning. 3. udg. Redaktionel Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. BD Laboratories. Catalase-Gotario reagens. Tilgængelig på:
5. Vadequímica Laboratories. Peroxid. Ækvivalens mellem volumener og procentdel. Fås på: vadequimica.com