OXIDASETEST: BEGRUNDELSE, PROCEDURE OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den oxidasetest er en diagnostisk metode, der viser tilstedeværelsen af enzymet kompleks kaldet cytochromoxidase c. Dette system inducerer omdannelse af reduceret cytochrom til oxideret, da det fanger ilt, og dette igen fungerer som den sidste elektronacceptor (H ⁺) i luftvejskæden.

Udtrykket oxidase er en kort måde at henvise til enzymet cytochrome oxidase, også kendt som indophenoloxidase. I gamle tider antages det, at enzymerne cytochrome oxidase og indophenoloxidase var to forskellige enzymer, men i dag vides de at være de samme.

Positiv og negativ oxidasetest. Kilde: Ingen maskinlæsbar forfatter leveret. Alpha.prim ~ commonswiki antaget (baseret på krav om ophavsret).

For deres del er cytokromer hæmoproteiner, der indeholder jern og kompletterer cytochromoxidasesystemet. Cytokromer kan variere fra art til art.

Der findes forskellige varianter af cytokromer (cytokromer a1, a2, a3 og 0). Nogle bakterier kan kun producere en, men andre op til to eller tre ad gangen. I denne forstand er tilstedeværelsen af ​​cytochrome a og a3 kendt som cytochrome oxidase c. Dette er den type cytochrom, som oxidasetesten registrerer.

Slægterne Neisseria og Pseudomonas indeholder cytochrome oxidase c. Disse slægter giver den positive oxidasetest, hvilket hjælper med at differentiere dem fra henholdsvis Acinetobacter- og Stenotrophomonas-slægterne.

Der er også andre slægter, der er oxidasepositive.

Basis

Karakteristika ved cytochrome oxidase c-systemet

Cytochrome oxidase c-systemet fungerer på følgende måde: oxidasepositive mikroorganismer bruger ilt til at generere energi gennem aerob respiration. Dette system fungerer takket være transporten af ​​elektroner fra donorsubstanser såsom NADH ⁺ til receptorsubstanser, i dette tilfælde ilt.

Dette resulterer i produktion af energi (ATP) og vand eller brintperoxid, afhængigt af det cytochrome oxidasesystem, som mikroorganismen besidder.

Derfor er de fleste af de oxidase-positive bakterier også katalasepositive, en nødvendig betingelse for at eliminere det producerede brintperoxid, da dette stof er giftigt for bakterier.

Cytochrome oxidase c-systemet er til stede i nogle aerobe bakterier, nogle fakultative anaerober, få mikroaerofile og ingen strenge anaerober. Det sidstnævnte er forståeligt, da strenge anaerober ikke kan leve i nærværelse af ilt, derfor mangler de cytokromoxidasesystemet.

Testprincip

I denne test bruger den stoffer, der fungerer som kunstige elektronacceptorer, og erstatter naturlige stoffer i elektrontransportkæden.

Hovedsagelig anvendes farvestoffer såsom paraphenylendiamin og indophenol, der fungerer som receptorsubstrater og kunstige elektrondonorer.

Paraphenylendiamin oxideres af cytochrome oxidase c-systemet. Farvestoffet i sin reducerede form er farveløst, men i sin oxiderede form er det farvet.

Dette er, hvordan tilstedeværelsen af ​​cytochrome oxidase c-systemet påvises; da en positiv reaktion vil generere en lavendel eller blå-lilla farve afhængigt af det anvendte reagens.

På den anden side, hvis det sidste elektron-accepterende stof i luftvejskæden er forskellig fra ilt, vil oxidasetesten være negativ (der er ingen farveproduktion); dette er tilfældet med anaerobe mikroorganismer.

Ligeledes, hvis den cytokrom, der bruges af mikroorganismen, er forskellig fra cytochromoxidase c, vil den også give den negative test.

Behandle

Der er forskellige reagenser og protokoller til oxidasetesten, alle til samme formål.

Reagenser

Kovacs-reagens, Gordon og McLeod-reagens, Nadi-reagens, Carpenter, Suhrland og Morrison-reagens og anvendelse af oxidaseskiver.

-Kovacs oxidasereagens

Det består af 1% tetramethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid.

Kovacs's reagens fremstilles ved at opløse 1 g af det ovennævnte stof i 50 ml destilleret vand. Det opvarmes subtilt, indtil det er helt opløst. Overfør til en rav flaske med tilstrækkelig kapacitet og fyld op til 100 ml med destilleret vand. Vent mindst 15 minutter, før du bruger det. Opbevares i køleskab beskyttet mod lys.

Det er mærket Kovacs oxidase-reagens for at differentiere det fra det Kovacs-reagens, der bruges til at afsløre indol-testen. Dette reagens er det mest følsomme, mindre giftige, men dyrere end resten af ​​reagenserne.

En positiv reaktion vil blive påvist med dette reagens med kolonifarveændringen til lavendel, som hurtigt bliver lilla næsten sort. En negativ reaktion er tydelig, fordi der ikke er nogen farveændring i kolonien, eller den får en let lyserød farve. Mediet kan også mørkne, men det betyder ikke en positiv reaktion.

Med dette reagens er reaktionstiden afgørende, en farveændring, der forekommer mellem 5 og 15 sekunder, betragtes som en positiv reaktion.

-Gordon og McLeod reagens

Det er sammensat af dimethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid, også kendt som N-dimethyl-p-phenylendiamin eller p-aminodimethylanilin-monohydrochlorid. Det fremstilles som beskrevet for Kovacs oxidase-reagenset i stedet for det involverede stof.

Dette reagens er lidt mere stabilt end Kovacs oxidase-reagens, skønt alle reagenser, der indeholder p-phenylendiamin, er ustabile.

Denne reaktion er senere, den fortolkes som positiv med udseendet af en blå-lilla farve inden for 10 til 30 minutter.

-Nadi reagens

Det er sammensat af 1% a-naphthol i ethylalkohol (95% ethanol) og 1% aminodimethylanilin. Blandingen fremstilles i lige store dele og under anvendelse af absolut ethylalkohol som et fortyndingsmiddel, indtil der udgør en tilstrækkelig mængde til 100 ml.

-Carpenter, Suhrland og Morrison reagens

Det er sammensat af 1% p-aminodimethylalaninoxalat. Forbered dig på samme måde som beskrevet for Kovacs oxidase-reagens, og skift for det tilsvarende stof.

Når opløsningen er klar, fremstilles teststrimler som følger: 6-8 cm Whatman nr. 1 filterpapirstrimler er imprægneret med 1% dimethyl-p-phenylendiaminoxalatreagens.

De får lov til at tørre uden kontakt med metal, opbevares i skruetrækkede krukker med tørremiddel og opbevares i køleskabet. Disse strimler er stabile i op til 6 måneder.

Det er det mest stabile reagens af alle de nævnte, og kan vare op til 6 måneder i opløsning. Et andet pluspoint er, at det ikke farver mediet omkring kolonien, hvis det bruges direkte på pladen.

Udseendet af en rød farve fortolkes som en positiv test.

-Oxidase-diske

Det er kommercielle diske, der er imprægneret med reagens til oxidasetesten. Der er flere kommercielle mærker på markedet.

Dets anvendelse er ganske praktisk, da det ikke er nødvendigt at fremstille friske reagenser, hvilket letter arbejdet. De opnåede resultater er pålidelige, så længe diske er korrekt bevaret.

protokoller

Direkte plademetode, indirekte metode på papir og brug af diske, der er imprægneret med oxidase-reagenser.

-Direktkortmetode

2 eller 3 dråber af hvilke som helst af de ovennævnte reagenser tilsættes til dette formål direkte på kolonien / kolonierne indeholdt i en plade af kulturmedium, der ikke indeholder glukose.

Ændringen eller ej af farve på kolonierne fortolkes, ikke af mediet. Den gyldige reaktionstid afhænger af det anvendte reagens.

-Indirekte metode på papir

Skær et stykke filterpapir (Whatman nr. 1) til en størrelse på 6 cm ² og anbring det i en tom petriskål.

Tilsæt 2 eller 3 dråber af Kovacs oxidase-reagenset på papiret, tag en del af kolonien, der skal undersøges, med et platinahåndtag eller trætænder, og spred det i en lige linje på det reagensimpregnerede papir. Tolk inden for 5 til 10 sekunder.

Med strimlerne fremstillet med Carpenter, Suhrland og Morrison reagens spredes en koloni på den tørre strimmel. En enkelt strimmel bruges til at teste adskillige stammer. Tolk på 10 sek.

-Diske (m

Fugt de kommercielle diske subtilt med sterilt destilleret vand og overlejre den koloni, der skal undersøges. Det anbefales at bruge pladerne ved 35 ° C, hvis der anvendes plader ved stuetemperatur eller køleplader, er reaktionen lidt langsommere. Fortolk farveændringen mellem 10 og 20 sek.

Kolonier indeholdt i blod eller chokoladeagar kan bruges.

-Diske (indirekte metode)

Fugt disken som tidligere beskrevet. Læg den i en tom petriskål. Tag en tilstrækkelig mængde af kolonien til at studere med et platinahåndtag eller trætænkepinde af træ og placere på disken. Fortolk farveændringen mellem 10 og 20 sek.

Brug

Slægten Neisseria og Acinetobacter er undertiden meget lignende morfologisk, fordi selv om slægten Acinetobacter er en Gram-negativ stav, kan den undertiden have en coccoid form og distribueres parvis, og simulere slægten Neisseria.

I dette tilfælde er oxidasetesten virkelig nyttig. Neisseria-slægten er positiv og Acinetobacter-negativ.

Slægten Moraxella ligner imidlertid slægten Neisseria og giver begge en positiv reaktion; Derfor skal kulhydratfermenteringstest altid udføres for endelig identifikation.

På den anden side er oxidasetesten nyttig til at differentiere en bakterie, der hører til familien Enterobacteriaceae (alle oxidase-negativ) fra andre gæringsmidler, såsom slægten Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidase-positiv).

Slægten Vibrio og Helicobacter er også oxidasepositive.

QA

Brug kendte stammer af Escherichia coli som en negativ kontrol og stammer af Pseudomonas aeruginosa som en positiv kontrol.

Begrænsninger

-Reagenserne skal bruges frisklavet, deres holdbarhed i opløsning ved stuetemperatur er kort, fordi de er meget ustabile. I køleskab kan de vare mellem 5 dage og 2 uger.

-Reagenserne er farveløse, hvis de ændrer farve, skal de kasseres. Beskadigede diske vises, fordi de bliver mørke over tid.

-En positiv reaktion med Kovacs oxidasereagens mellem 15-60 sek betragtes som en forsinket reaktion, og efter 60 sekunder skal den betragtes som negativ.

-Haemophylus influenzae giver en negativ oxidase-reaktion, hvis der anvendes noget reagens med dimethyl-p-phenylendiamin, men positivt, hvis Kovacs oxidase-reagens (tetramethyl-p-phenylenediamin) anvendes.

-Medier, der indeholder glukose, forstyrrer testen og giver falske negativer.

-Bordetella pertussis-stammer kan give en falsk positiv reaktion, hvis de kommer fra stærkt koncentrerede blodagarplader.

-Brug af metal (jern) håndtag giver en falsk positiv reaktion.

anbefalinger

-Fordi reagenserne er meget ustabile og har tendens til selvoxidering, anbefales det at fryse portioner på 1 til 2 ml og fjerne efter behov.

-En anden måde at forsinke auto-oxidationen af ​​reagenset er at tilsætte 0,1% ascorbinsyre, når reagenserne tilberedes.

-Som reagenserne er ustabile, anbefales en ugentlig kvalitetskontrol.

-Reagenser, der ikke består kvalitetskontroltesten, bør ikke anvendes.

Referencer

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
3. "Oxidasetest." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 15. jan. 2018, 10:32 UTC. 3. april 2019, 14:03
4. Verdenssundhedsorganisationen. Laboratoriehåndbog til identifikation og antimikrobiel modtagelighedstest af bakterielle patogener af folkesundhedsmæssig betydning i udviklingslandene. 2004. Fås på: who.int/drugresistance/infosharing
5. Reagensstrimler til diagnose af oxidaseaktivitet i bakterier. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.