FOSFATBUFFER (PBS): BEGRUNDELSE, KLARGØRING OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den phosphatbuffer, phosphatbufret saltvand eller BPS er en puffer isotonisk, hvis funktion er at opretholde pH og det osmotiske tryk så tæt på den naturlige biologiske miljø (fysiologisk). Forkortelsen PBS står for phosphatbufret saltvand.

PH og osmolaritet er to meget vigtige aspekter, der skal kontrolleres i visse laboratorieprotokoller. I tilfælde af pH er det vigtigt, at det kontrolleres, især i biokemiske reaktioner, da disse kan variere eller ikke udføres, hvis reaktanterne har en upassende pH.

PBS-phosphatpufret saltvand ved to forskellige pH'er. Kilde: Pixinio.com

I mellemtiden er kontrol med osmolaritet vigtig, især når man arbejder med levende celler, da cellernes plasmamembraner reagerer i henhold til koncentrationen af ​​opløste stoffer, i hvilke de findes.

Hvis cellerne overføres til et hypertonisk medium, bliver de dehydreret, da vandgradienten vil blive transporteret til den side, hvor der er en højere koncentration af opløste stoffer. Hvis celler på den anden side placeres i et hypotonisk medium, vil cellerne absorbere væske, indtil de lyseres.

Derfor bruges PBS-buffer til laboratorieprotokoller, der kræver vedligeholdelse af celler in vitro, på denne måde vil cellerne ikke blive beskadiget.

PBS består af en kombination af salte, såsom natriumchlorid, natriumphosphat, kaliumchlorid og kaliumphosphat. Sammensætningen af ​​PBS kan variere afhængigt af protokollen.

Basis

Grundlæggende er funktionen af ​​fosfatbufferen at opretholde en konstant fysiologisk pH sammen med en elektrolytkoncentration svarende til den, der findes inde i kroppen.

I dette miljø er celler i stand til at forblive stabile, da fysiologiske forhold simuleres så meget som muligt.

Andre forbindelser kan sættes om nødvendigt til den originale PBS-formulering, for eksempel er tilsætningen af ​​EDTA til pufferen nyttig til vask af røde blodlegemer i kryds-inkompatibilitetstesten.

EDTA forhindrer, at fraktionen af ​​komplement C1, der er til stede i serum, spaltes og lyseres til de røde blodlegemer, dvs. at den undgår falske inkompatibilitetsresultater. Derudover hjælper EDTA med at dissociere celler.

Forberedelse

Mængden af ​​salte, der skal vejes til fremstilling af PBS-phosphatpufret saltvand, afhænger af den mængde, der skal fremstilles:

-Phosphatbufret saltopløsnings stamopløsning (10X PBS)

For en liter opløsning:

At veje:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCI, 11,5 g Na ₂ HPO ₄, 2,0 g KH ₂ HPO ₄

Forberedelse teknik

Anbring de tunge salte i et bægerglas, tilsæt nok vand (80%) og bland på omrøringspladen med magnetisk stang, indtil saltene er opløst.

Fremstilling af PBS under anvendelse af en omrøringsplade med en magnetisk stang. Kilde: Bruger: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtrer for at fjerne uopløste partikler. Brug filtre med porer på 0,45 um. Autoklaver og distribuer aseptisk i en laminær flowhætte i glasskruer med låg.

10X-opløsningen (koncentreret) justerer ikke pH-værdien. Justeringen foretages, når den er fortyndet til 1X PBS-bufferkoncentration (1:10 fortynding).

-Bufferphosphat saltvand (1X PBS)

1X PBS kan fremstilles direkte ved at veje de tilsvarende mængder af hvert salt, eller det kan fremstilles ved at fortynde stamopløsningen (1:10) med sterilt destilleret vand.

-For at fremstille direkte en liter 1X PBS phosphatbufret saltvand, vejer:

8,06 g NaCl, 0,22 g KCI, 1,15 g Na ₂ HPO ₄, 0,20 g KH ₂ HPO ₄

Forberedelse teknik

Fortsæt som forklaret i den koncentrerede opløsning. Efterfølgende skal pH justeres. For at gøre dette skal du måle pH og afhængigt af resultatet bruge syre (HCI) eller base (NaOH) til henholdsvis at sænke eller hæve pH, indtil det er 7,4.

Syren eller basen tilsættes dråbe for dråbe, mens pH-værdien af ​​opløsningen overvåges under anvendelse af en pH-meter. Filtrer, autoklaver og fordel aseptisk i koniske rør eller krukker efter behov.

-For at forberede 1X PBS fra 10X stamopløsningen:

Lav en fortynding på 1:10. For eksempel at fremstille 1 liter 1X PBS, måle 100 ml af stamopløsningen og tilsætte 700 ml sterilt destilleret vand. Juster pH-værdien, og fyld mængden af ​​vand op til 1000 ml.

Den tilberedte PBS-buffer er farveløs og klar.

Daglig PBS kan opbevares ved stuetemperatur og resten i køleskabet.

Opløsninger til pH-justering

HCI

For 100 ml 1 mol HCL (saltsyre).

Mål 91 ml destilleret vand, og anbring det i et 250 ml bægerglas.

Mål 8,62 ml koncentreret HCI og tilsæt den langsomt til bægeret, der indeholder vandet (gør det aldrig omvendt). Tag passende biosikkerhedsforanstaltninger, når du håndterer stærke syrer (stærkt ætsende stof).

Bland i 5 minutter, fortrinsvis ved hjælp af en omrøringsplade med en magnetisk stang inde i glasset. Overførsel til en 100 ml kolbe, og der fyldes op til 100 ml med destilleret H ₂ O.

NaOH

For 100 ml NaOH (natriumhydroxid) 10 mol.

Mål 40 ml destilleret vand, og anbring det i et 250 ml bægerglas. Mål 40 g NaOH og føj til vandet. Bland ved hjælp af en omrøringsplade med en magnetisk stang inde i glasset.

Overfør til en 100 ml målekolbe og fyld op til mærket med destilleret vand. Overhold reglerne om biosikkerhed, fordi denne reaktion er eksoterm (den frigiver energi i form af varme).

Hvis du vil tilberede andre mængder fosfat saltopløsning, kan du se følgende tabel:

Kilde: «Laboratory for Viral and Human Genomics, UASLP School of Medicine»

Applikationer

Det bruges primært inden for cellebiologi, immunologi, immunohistokemi, bakteriologi, virologi og forskningslaboratorier.

Det er ideelt til cellevask ved centrifugering (røde blodlegemer), celle monolags vaske, i spektroskopiske ellipsometri teknikker, til kvantificering af bakterielle biofilmer, til vedligeholdelse af cellekulturer for vira, som en vaskeopløsning i den indirekte immunofluorescens teknik og i teknikker til karakterisering af monoklonale antistoffer.

Det bruges også til at transportere celler eller væv, som et fortyndingsmiddel til celletælling, fremstilling af cellulære enzymer (trypsin), som et fortyndingsmiddel til biomolekyleudtørningsmetoden og til fremstilling af andre reagenser.

På den anden side demonstrerede Martin et al. I 2006, at PBS er nyttigt i retsmedicinske videnskabelige laboratorier, specifikt til nyttiggørelse af sæd fra vaginal udstødning eller til genvinding af vaginale celler fra penisudstrygning. På denne måde kan det fastslås, om der har været et seksuelt forhold.

Begrænsninger

-Nogle PBS-buffere indeholder et stof kaldet natriumazid som konserveringsmiddel. Denne forbindelse kan generere eksplosive stoffer, hvis den kommer i kontakt med bly eller kobber. Af denne grund skal der udvises særlig omhu, når dette reagens bortskaffes ned i drænet. Hvis det kasseres på denne måde, skal der tilsættes masser af vand for at fortynde det så meget som muligt.

-Zink bør ikke sættes til phosphatbufferen, da det får nogle salte til at udfælde.

-Wangen og samarbejdspartnere i 2018 bestemte, at brugen af ​​PBS ikke var egnet til at vaske primære celler af akut myelooid leukæmi (AML) ekstraheret fra perifert blod på grund af det faktum, at mange celler går tabt ved lysis, med et stort fald i materialet protein.

Derfor bestemte de, at primære AML-celler ikke skulle vaskes med PBS efter opbevaring i flydende nitrogen.

Referencer

1. Coll J. (1993). Diagnostiske teknikker i virologi. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Cellekultur. Ændring af medium. Institut for Normal og Patologisk Cytologi og Histologi Universitet i Sevilla. Fås på personal.us.es
3. Fremstilling af phosphatbufret saltvand (PBS). (2008). Standard driftsprocedurer (SOP'er) Human and Viral Genomics Laboratory UASLP School of Medicine. Fås på: genomica.uaslp.mx
4. "Fosfatbuffersalt." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 3 apr. 2019, 19:36 UTC. 13. april 2019, 02:57 da.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Emner i molekylær biofysik. Fås på: brugere.df.uba.ar
6. Rediar. Brugervejledning. PBS + EDTA. Fås på: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Anvendelse af fosfatbufret saltvand til nyttiggørelse af celler og spermatozoer fra vatpinde. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. Fås på: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, et al. Konserveringsmetode og fosfatbufret saltvask påvirker det akutte myeloide leukæmi-protein. Int J Mol Sci. 2018 19 (1): 296. Fås på: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Teoretiske og praktiske fundamenter i histokemi. Overordnet råd for videnskabelige undersøgelser. Madrid. Fås på: books.google.co.ve