UREA BOUILLON: FUNDAMENT, KLARGØRING OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den urinstof bouillon er et flydende dyrkningsmedium, der anvendes til at detektere tilstedeværelsen af urease enzym i visse mikroorganismer. Urease er et mikrobielt enzym, der produceres på en konstitutiv måde, dvs. at det syntetiseres, uanset om det underlag, hvorpå det virker, er til stede.

Ureasens funktion er relateret til nedbrydning af organiske forbindelser. Ikke alle mikroorganismer er i stand til at syntetisere dette enzym, derfor er dets bestemmelse i laboratoriet det muligt at identificere visse bakteriestammer og endda differentiere mellem arter af samme slægt.

Negativ og positiv urinstof. Kilde: Foto taget af forfatteren MSc. Marielsa Gil.

Der er to typer urinstest: Stuart og Christensen. De er forskellige i sammensætning og følsomhed. Den første er speciel for at vise en stor mængde urease produceret af arter af slægten Proteus.

Den anden er mere følsom og kan påvise små mængder urease, der er genereret sent af andre bakteriegener, såsom Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter og Mycobacterium.

Stuarts Urea Bouillon består af urea, natriumchlorid, Dipotassium Phosphate, Monopotassium Phosphate, gærekstrakt, Phenol Red og destilleret vand.

I mellemtiden er Christensens urinstof bouillon eller agar sammensat af peptoner, natriumchlorid, monopotassiumphosphat, glukose, urinstof, fenolrødt, destilleret vand og agar-agar. Sidstnævnte kun, hvis det er det faste medium.

Basis

Enzymet urease hydrolyserer urinstof til dannelse af carbondioxid, vand og to molekyler ammoniak. Disse forbindelser reagerer og danner slutproduktet kaldet ammoniumcarbonat.

Stuarts urea buljong

Stuarts urinstoffer er mere bufret med en pH på 6,8. Derfor skal mikroorganismen være i stand til at danne store mængder ammoniak for at gøre fenolrød. PH-værdien skulle stige over 8.

Derfor er Stuarts urinstof bouillon selektiv for Proteus-arter, hvilket giver positive resultater inden for 24 til 48 timer efter inkubation, og det er ikke effektivt for bakterier, der producerer lave mængder urease, eller som langsomt hydrolyserer urinstof.

Dette skyldes, at Proteus-arter er i stand til at bruge urinstof som nitrogenkilde. I stedet har andre urease-producerende bakterier brug for en yderligere kilde.

Pérez et al. (2002) bestemte, at Stuarts urinstof var så effektiv som Christensens urinstofagar til bestemmelse af urease i gærstammer af slægterne Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon og Saccharomyces.

Undersøgelsesforfatterne hævder at have opnået 100% aftale med begge medier (Stuart og Christensen), når de blev inkuberet i 24 og 48 timer; med undtagelse af, at stammer, der formåede at vende medierne til en stærk pink-fuchsia-farve, blev taget som positive.

Denne afklaring er nødvendig, da Lodder (1970) erklærede, at næsten alle gærer formår at gøre Christensen urea agar-affasning til lyserosa. Dette skyldes det faktum, at de kan hydrolysere urinstof i minimale mængder, og dannelsen af ​​aminer ved oxidativ dekarboxylering af aminosyrer på overfladen. Dette skal ikke fortolkes som positivt.

Christensens urea-agar eller bouillon

Christensens urinstoffer eller agar er mindre bufret, idet det er i stand til at detektere små mængder ammoniak. Yderligere er dette medium beriget med peptoner og glukose. Disse forbindelser får andre urease-producerende mikroorganismer til at vokse, som ikke vokser i Stuart-bouillon.

Ligeledes giver Christensen urea-test hurtigere resultater, især for Proteus, der er i stand til at give stærkt positive på kun 30 minutter som en minimumstid og op til 6 timer som en maksimal tid.

Resten af ​​de urease-producerende mikroorganismer formår at vende farven på mediet lidt efter 6 timer og stærkt efter 24, 48, 72 timer eller mere, og endda nogle stammer kan give svage reaktioner efter 5 eller 6 dage.

Fortolkning af begge medier (Stuart og Christensen)

Mediet er oprindeligt gul-orange i farve, og en positiv reaktion vil gøre farven på mediet til pink-fuchsia. Farveintensiteten er direkte proportional med mængden af ​​produceret ammoniak.

En negativ reaktion efterlader mediet med den originale farve med undtagelse af gær, der kan blive lyserosa på Christensens urinstofagarmedium.

Forberedelse

Stuarts urea buljong

Vej de nødvendige gram i henhold til det kommercielle selskabs indikationer. Opløs i fortrinsvis sterilt destilleret vand. Brug ikke varme til at opløse, da urinstof er følsom over for varme.

Membranfiltrering bruges til sterilisering. Til dette bruges et Millipore-filter med porer med en diameter på 0,45 u. Brug ikke en autoklav. Når opløsningen er filtreret, fordeles den i sterile rør. For at opnå pålidelige resultater skal det overføres mellem 1,5 ml som en minimumsmængde og 3 ml som en maksimal mængde pr. Rør.

Opbevares i køleskab og varm inden brug.

Hvis filtreringsmetoden ikke er tilgængelig, skal mediet bruges øjeblikkeligt for at opnå pålidelige resultater.

En anden måde at forberede Stuarts urea buljong er som følger:

Nogle kommercielle huse sælger basemediet til urinstof, ikke inklusive urinstof.

Den mængde, der er angivet af det kommercielle selskab, vejes. Det opløses i destilleret vand og steriliseres i autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter. Det lodes hvile lidt, og når mediet er varmt, tilsættes 100 ml af en urinstofopløsning tilberedt ved 20% og steriliseres ved filtrering.

Det distribueres i sterile rør, som tidligere beskrevet.

Christensens urea-agar eller bouillon

-Præparation af urinstofopløsningen

Vej 29 g dehydreret urinstof og opløs i 100 ml destilleret vand. Brug filtreringsmetoden til sterilisering. Autoklaver ikke.

-Urea base agar

Opløs 24 g af den dehydratiserede base agar i 950 ml destilleret vand. Steriliser i autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter. Lad det hvile, indtil det når en temperatur på 50 ° C, og tilsæt det tidligere fremstillede urinstof aseptisk.

Hell 4-5 ml i sterile rør, og vip, indtil de er faste. Der skal være en lang fløjtebeb.

Dette medium kan også fremstilles i flydende form.

Applikationer

Urea-test er ekstremt effektiv til at skelne slægten Proteus fra andre slægter i Family Enterobacteriaceae, i betragtning af den hurtige reaktion, som Proteus giver.

Ved hjælp af Christensen-sammensætningen hjælper testen med at skelne mellem arter af samme slægt. F.eks. Er S. haemolyticus og S. warneri koagulase-negativ og beta-hemolytisk Staphylococcus, men adskiller sig fra hinanden i, at S. haemolyticus er urinstof-negativ og S. warneri er urinstof-positiv.

På den anden side brugte McNulty med succes Christensens 2% urinstof bouillon til at undersøge tilstedeværelsen af ​​Helicobacter pylori i biopsiprøver taget fra maveslimhinden (antral region).

Tilstedeværelsen af ​​H. pylori bevises ved en positiv urinstof. Varigheden af ​​at observere resultaterne er direkte proportional med mængden af ​​tilstedeværende mikroorganismer.

Som det kan ses, er det en enkel metode til diagnose af Helicobacter pylori i gastriske biopsier.

Endelig er denne test også nyttig til at differentiere arter fra slægterne Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus og Mycobacteria.

Såning af urinstof test

Begge metoder kræver en stærk mikrobiel inokulum for at optimere resultaterne. Bakteriekolonier tages fortrinsvis fra blodagar og gær fra Sabouraud-agar med nogle få undtagelser. Inokulatet emulgeres i det flydende medium.

Til Stuarts urinstoffer, inkuber ved 37 ° C i 24 til 48 timer, vel vidende, at du kun leder efter stammer af slægten Proteus, når stammen er en bakterie. For gær kan det inkuberes ved 37 ° C eller ved stuetemperatur i 24 til 48 timers inkubation.

For så vidt angår Christensens urinstof, inkuberes den ved 37 ºC i 24 timer. Hvis testen er negativ, kan den inkuberes i op til 6 dage. Hvis testen er positiv inden 6 timer, indikerer det, at den er en stamme af slægten Proteus.

I tilfælde af Christensens ureaagar inokuleres agarskråningen kraftigt uden punktering. Bouillon inkuberes og fortolkes på samme måde.

QA

Kontrolstammer såsom Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 og Salmonella typhimurium kan anvendes til at teste mediet. De to første skal give positive resultater og de to sidste negative resultater.

Kilde: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.

Referencer

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Anvendelse af Stuarts urinstoffet til urease-testen som en test i diagnosticering af gær. Præsten Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Fås på: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biokemiske test til identifikation af bakterier af klinisk betydning. 3. udg. Redaktionel Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (Urea agar base) 2015. Tilgængelig på: britanialab.com