CYTOKEMI: HISTORIE, STUDIENS GENSTAND, ANVENDELIGHED OG TEKNIKKER - BIOLOGI

Den cytokemi omfatter en række teknikker, som beror på identifikation og disposition af specifikke stoffer inde i cellen. Det betragtes som en gren af cellebiologi, der kombinerer cellemorfologi med kemisk struktur.

Ifølge Bensley, grundlægger af anvendelsen af moderne cytologi, udtrykker det, at formålet med cytokemi er at opdage den kemiske organisering af celler for at forstå livets mysterier. Samt at studere de dynamiske ændringer, der forekommer i de forskellige funktionelle stadier.

1: Pagets ekstramammar sygdom. (Hematoxylin-Eosin) 2: senile plaques observeret i hjernebarken hos en patient med Alzheimers sygdom. (Sølvimprægnering) 3: Kanintunge, kollagenfibre (blå). Muskelfibre (lilla strimler). (Massons trichrome). 4: Levervæv med fedtgenerering. (Sudan III) 5: Betændelig lever. Nekrose. (Toluidine blå) Kilder: Wikipedia. com / Bruger: KGH / Public Domain-filer / Mohit Lalwani

På denne måde er det muligt at bestemme den metaboliske rolle, disse stoffer spiller i cellen.

Cytokemi bruger to hovedmetoder. Den første er baseret på kemiske og fysiske procedurer. Disse teknikker tyr til brugen af mikroskopet som et uundværligt instrument til at visualisere de kemiske reaktioner, der forekommer på specifikke stoffer i cellen.

Eksempel: anvendelse af cytokemiske farvestoffer, såsom Feulgen-reaktion eller PAS-reaktion, blandt andre.

Den anden metode er baseret på biokemi og mikrokemi. Med denne metode er det muligt kvantitativt at bestemme tilstedeværelsen af intracellulære kemikalier.

Blandt de stoffer, der kan afsløres i et væv eller en cellestruktur, er følgende: proteiner, nukleinsyrer, polysaccharider og lipider.

Cytokemi-historie

Cytokemiske teknikker siden deres opfindelse har bidraget til at forstå sammensætningen af celler, og med tiden er der fremkommet en række teknikker, der bruger forskellige typer farvestoffer med forskellige affiniteter og grundlæggende elementer.

Derefter åbnede cytokemi nye horisonter med anvendelse af visse substrater for at vise kolorimetrisk tilstedeværelsen af enzymer eller andre molekyler i cellen.

Ligeledes er der fremkommet andre teknikker, såsom immunocytokemi, der har været til stor hjælp i diagnosen af mange sygdomme. Immunocytokemi er baseret på antigen-antistofreaktioner.

På den anden side har cytokemi også brugt fluorescerende stoffer kaldet fluorokromer, som er fremragende markører til påvisning af visse cellestrukturer. På grund af egenskaber ved fluorokrom fremhæver det de strukturer, som det er knyttet til.

Hvad læser du?

De forskellige cytokemiske teknikker, der bruges på en biologisk prøve, har noget til fælles: De afslører tilstedeværelsen af en bestemt type stof og kender dens placering i den biologiske struktur, der er under vurdering, hvad enten det er en celletype eller et væv.

Disse stoffer kan være enzymer, tungmetaller, lipider, glykogen og definerede kemiske grupper (aldehyder, tyrosin osv.).

Oplysningerne leveret af disse teknikker kan give vejledning ikke kun til identifikation af celler, men også til diagnose af forskellige patologier.

For eksempel er cytokemiske pletter meget nyttige til at skelne mellem de forskellige typer leukæmier, da nogle celler udtrykker visse enzymer eller nøglesubstanser, og andre ikke.

På den anden side skal det bemærkes, at for at muliggøre anvendelse af cytokemi, skal følgende overvejelser tages:

1) Stoffet skal immobiliseres på det sted, hvor det findes naturligt.

2) Stoffet skal identificeres ved hjælp af substrater, der reagerer specifikt med det og ikke med andre forbindelser.

Utility

De prøver, der kan studeres ved hjælp af cytokemiske teknikker, er:

- Udvidet perifert blod.

- Udvidet knoglemarv.

- Væv, der er faste til histokemiske teknikker.

- Celler fikseret ved cytocentrifugering.

Cytokemiske teknikker er yderst understøttende inden for hæmatologi, da de er vidt brugt til at hjælpe med diagnosticering og differentiering af visse typer leukemier.

For eksempel: Esterase-reaktioner anvendes til at differentiere myelomonocytisk leukæmi fra akut monocytisk leukæmi.

Knoglemarv og perifert blodudstrygning fra disse patienter er ens, da nogle celler er vanskelige at identificere morfologisk alene. Til dette udføres esterasetesten.

I den første er specifikke esteraser positive, mens i den anden er ikke-specifikke esteraser positive.

De er også meget nyttige i histologi, da for eksempel anvendelsen af tungmetalfarvningsteknikken (sølvimprægnering) farver de retikulære fibre med en intens brun farve i det myocardiale væv.

Teknikker inden for cytokemi

De mest anvendte teknikker vil blive forklaret nedenfor:

- Brug af farvestoffer

De anvendte pletter er meget forskellige i cytokemiske teknikker, og disse kan klassificeres efter flere synsvinkler:

I henhold til det radikale, som de har en tilhørighed for

De er opdelt i: sure, basiske eller neutrale. De er de enkleste og mest anvendte gennem historien, så vi kan skelne de basofile komponenter fra de acidofile. Eksempel: hæmatoxylin-eosinfarvning.

I dette tilfælde farves cellernes kerner blå (de tager hæmatoxylin, som er den grundlæggende farvning), og cytoplasmerne røde (de tager eosin, som er den sure plet).

I henhold til den farve, de leverer

De kan være ortokromatisk eller metachromatisk. De ortokromatiske er dem, der farver strukturerne i samme farve som farvestoffet. For eksempel tilfældet med eosin, hvis farve er rød og farver rød.

På den anden side strukturerer metachromatik en anden farve end deres, såsom for eksempel toluidin, hvis farve er blå og alligevel farver violet.

Vital eller supravital farvestoffer

De er ufarlige farvestoffer, det vil sige, de farver celler, og de forbliver i live. Disse pletter kaldes vitale (f.eks. Trypan blå til farvning af makrofager) eller supravital (f.eks. Janus grøn til at plette mitokondrier eller neutral rød til pletlysosomer).

- Påvisning af lipider ved hjælp af fedtopløselige farvestoffer

Osmiumtetroxid

Det pletter lipider (umættede fedtsyrer) sort. Denne reaktion kan observeres med lysmikroskopet, men fordi dette farvestof har høj densitet, kan det også visualiseres med et elektronmikroskop.

Sudan III

Det er en af de mest anvendte. Dette farvestof diffunderer og opløseliggøres i vævene og akkumuleres inde i lipiddråberne. Farven er hvidrød.

Sudans sort plet B

Det producerer bedre kontrast end de foregående, fordi det også er i stand til at opløses i phospholipider og kolesterol. Det er nyttigt til påvisning af azurofile og specifikke granuler af modne granulocytter og deres forstadier. Derfor identificerer det myeloide leukæmier.

- Aldehydgruppefarvning (periodisk syre Schiff-plet)

Periodisk syre Schiff-plet kan påvise tre typer aldehydgrupper. De er:

- Gratis aldehyder, naturligt til stede i væv (plasmareaktion).

- Aldehyder produceret ved selektiv oxidation (PAS-reaktion).

- Aldehyder genereret ved selektiv hydrolyse (Feulgen-reaktion).

PAS-reaktion

Denne farvning er baseret på påvisning af visse typer kulhydrater, såsom glycogen. Periodisk syre Schiff bryder CC-bindingerne af kulhydrater på grund af oxidationen af glykoliske grupper 1-2 og formår at frigive aldehydgrupper.

Frie aldehydgrupper reagerer med Schiffs reagens og danner en lilla-rød forbindelse. Udseendet af den lilla-røde farve viser en positiv reaktion.

Denne test er positiv i planteceller og detekterer stivelse, cellulose, hemicellulose og peptiner. Mens det i dyreceller detekterer muciner, mucoproteiner, hyaluronsyre og chitin.

Derudover er det nyttigt til diagnosticering af lymfoblastiske leukæmier eller erythroleukæmi, blandt andre patologier af den myelodysplastiske type.

I tilfælde af sure kulhydrater kan den alcianske blå plet anvendes. Testen er positiv, hvis der observeres en lyseblå / turkis farve.

Plasmal reaktion

Plasmareaktionen afslører tilstedeværelsen af visse langkædede alifatiske aldehyder, såsom palme og stearal. Denne teknik anvendes på frosne histologiske sektioner. Det behandles direkte med Schiffs reagens.

Feulgen reaktion

Denne teknik detekterer tilstedeværelsen af DNA. Teknikken består i at udsætte det faste væv for en svag sur hydrolyse for senere at få det til at reagere med Schiffs reagens.

Hydrolyse udsætter deoxyribose-aldehydgrupperne ved deoxyribose-purin-bindingen. Schiffs reagens reagerer derefter med de aldehydgrupper, der blev efterladt fri.

Denne reaktion er positiv i kernerne og negativ i cellernes cytoplasmer. Positivitet fremgår af tilstedeværelsen af en rød farve.

Hvis denne teknik er kombineret med methylgrøn-pyronin, er det muligt samtidig at påvise DNA og RNA.

- Cytokemiske pletter til proteinstrukturer

Til dette kan Millon-reaktionen anvendes, der bruger kviksølvnitrat som reagens. Strukturer, der indeholder aromatiske aminosyrer, farves røde.

- Cytokemiske pletter, der bruger underlag til at vise tilstedeværelsen af enzymer

Disse pletter er baseret på inkuberingen af den biologiske prøve med et specifikt substrat, og reaktionsproduktet reagerer derefter med diazosalte til dannelse af et farvet kompleks.

esteraser

Disse enzymer er til stede i lysosomerne i nogle blodlegemer og er i stand til at hydrolysere organiske estere, der frigiver naphthol. Sidstnævnte danner et uopløseligt azofarvestof, når det binder sig til et diazosalt, hvorved farvning på stedet, hvor reaktionen finder sted.

Der er flere underlag, og afhængigt af hvilken der bruges, kan specifikke esteraser og ikke-specifikke esteraser identificeres. Førstnævnte findes i umodne celler i myeloide serien og sidstnævnte i celler af monocytisk oprindelse.

Det underlag, der anvendes til bestemmelse af specifikke esteraser, er: naphthol-AS-D-chloracetat. Selv om bestemmelsen af ikke-specifikke esteraser kan anvendes flere substrater, såsom naphthol AS-D-acetat, alfa-naphthylacetat og alfa-naphthylbutyrat.

I begge tilfælde pletter cellerne dybt rødt, når reaktionen er positiv.

myeloperoxidase

Dette enzym findes i de azurofile granuler af granulocytiske celler og monocytter.

Dets detektion bruges til at differentiere leukemier af myeloide oprindelser fra lymfoide. Celler, der indeholder myeloperoxidaser, bliver okergule.

fosfataser

Disse enzymer frigiver fosforsyrer fra forskellige underlag. De adskiller sig fra hinanden afhængigt af substratets specificitet, pH og virkningen af hæmmere og inaktiveringsmidler.

Blandt de bedst kendte er de phosphomonoesteraser, der hydrolyserer simple estere (PO). Eksempel: alkalisk phosphatase og sur phosphatase samt phosphamidaser, der hydrolyserer bindingerne (PN). Disse bruges til at differentiere lymfoproliferative syndromer og til diagnose af hårcelle leukæmi.

- Trikromiske farvninger

Mallary-Azan Trichrome

De er nyttige til at differentiere cytoplasmaet fra celler fra fibrene i bindevæv. Celler pletter rød og kollagenfibre blå.

Massons trichrome

Dette har den samme nytte som den foregående, men i dette tilfælde pletter cellerne røde og kollagenfibrene grønne.

- Farvestoffer, der pletter specifikke organeller

Janus Green

Det farver selektivt mitokondrierne.

Sølvsalte og osminsyre

Flekker Golgi-apparatet.

Toluidine blå

Flekker Nissis kroppe

Sølvsalte og PAS

De pletter retikulære fibre og basalaminaen.

Orcein og fuchsin resorcin

De farver elastiske fibre. Med den første farves de brune og med den anden dybblå eller lilla.

- Andre teknikker, der anvendes i cytokemi

Brug af fluorescerende stoffer eller fluorokromer

Der er teknikker, der bruger fluorescerende stoffer til at undersøge placeringen af en struktur i en celle. Disse reaktioner visualiseres med et specielt mikroskop kaldet fluorescens. Eksempel: IFI-teknik (indirekte immunfluorescens).

Påvisning af cellulære komponenter ved immunocytokemi

Disse teknikker er meget nyttige i medicinen, da de hjælper med at detektere en bestemt cellestruktur og også kvantificere den. Denne reaktion er baseret på en antigen-antistofreaktion. For eksempel: ELISA-teknikker (enzymimmuno-analyse).

anbefalinger

- Det er nødvendigt at bruge kontroludstrygning for at evaluere farvestoffernes gode ydeevne.

- Friske udstrygninger skal bruges til at gennemgå cytokemisk farvning. Hvis det ikke er muligt, skal de holdes beskyttet mod lys og opbevares ved 4 ° C.

- Det skal udvises omhu, at det anvendte fikseringsmiddel ikke påvirker stoffet, der skal undersøges negativt. Med andre ord skal det forhindres i at være i stand til at udtrække eller hæmme det.

- Tidspunktet for brug af fikseringsmidler skal overholdes, da det generelt kun skal vare sekunder, da udsættelse af udstrygningen i længere tid for fikseringsmidlet kan beskadige nogle enzymer.

Referencer

"Cytokemi." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 30. juni 2018, 17:34 UTC. 9. jul 2019, 02:53 Tilgængelig på: wikipedia.org
Villarroel P, de Suárez C. Metallisk imprægneringsmetoder til undersøgelse af myokardielle retikulære fibre: Sammenlignende undersøgelse. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Fås på: scielo.org
Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Cytokemi af syrephosphatase: metodologiske overvejelser. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89-92. Fås på: scielo.org
De Robertis E, De Robertis M. (1986). Cellulær og molekylærbiologi. 11. udgave. Redaktionel Ateneo. Buenos Aires, Argentina.
Klassiske værktøjer til studier af cellebiologi. TP 1 (supplerende materiale) - Cellebiologi. Fås på: dbbe.fcen.uba.ar

CYTOKEMI: HISTORIE, STUDIENS GENSTAND, ANVENDELIGHED OG TEKNIKKER - BIOLOGI - 2025