DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOL): KARAKTERISTIKA, BEGRUNDELSE, ANVENDELSE - KEMI - 2025

Den DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindol) er et farvestof ved fluorescens-egenskab tjener som en markør, som er almindelig anvendt i teknikken af fluorescensmikroskopi eller flowcytometri, blandt andre. Den fluorescens, den udsender, er lyseblå, dens excitation forekommer mellem 455-461 nm (UV-lys).

DAPI-farvestof kan passere gennem cellemembranen i døde celler med stor lethed. Det kan også plette kerne i levende celler, men i dette tilfælde skal koncentrationen af ​​dette være højere.

Kemisk struktur af det fluorescerende farvestof DAPI. Kilde: Image: File: DAPI.svg er en vektorversion af denne fil. Det skal bruges i stedet for dette rasterbillede, når det ikke er dårligere / Richard Wheeler (Zephyris) Redigeret billede

Farvestoffet er i stand til at få adgang til cellulært DNA, for hvilket det har en særlig affinitet, og som med stor aviditet binder til nitrogenholdige baser adenin og thymin. Af denne grund er det meget nyttigt i nogle molekylærbiologiske teknikker.

Denne forbindelse hører til gruppen af ​​indolfarvestoffer og har vist sig at have større følsomhed over for DNA end ethidiumbromid og propidiumiodid, især på agarosegeler.

Brugen af ​​dette fluorescerende farvestof er meget bredt, da det er nyttigt til: at studere ændringer i DNA i apoptotiske processer (celledød) og derfor at detektere celler i denne proces; til DNA-fotaftryksfoto (DNA-fotoudskrivning); at undersøge bakterieforurening eller at visualisere nuklear segmentering.

Det er også blevet brugt i undersøgelsen af ​​kromosomale bånd, til påvisning af Mycoplasmas sp DNA, i DNA-protein-interaktion, til farvning og tælling af celler ved immunofluorescens og endda til at farve modne pollenkorn.

egenskaber

DAPI er forkortelsen af ​​dets kemiske navn (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol). Dens molekylformel er C ₁₆ H ₁₅ N _5. Den har en molekylvægt på 350,3. I nærheden af ​​UV-lysområdet (345 til 358 nm) forekommer den maksimale excitation af DAPI-DNA-komplekset, mens den maksimale fluorescensemission sker mellem 455-461 nm.

Dette farvestof er karakteriseret som et gult pulver, men strukturer markeret med denne fluorofor udsender et strålende blåt lys.

Det er en forbindelse, der er opløselig i vand, for at fremskynde dens opløsning kan der dog tilføres nogen varme. Det kan fortyndes med PBS, men ikke direkte opløses i det.

Når farvestoffet er klargjort, skal det opbevares i mørke, det vil sige beskyttet mod lys, ved en temperatur på 2 til 8 ° C (køleskab). Under disse forhold er farvestoffet stabilt i mere end 3 uger eller måneder.

Hvis den er beskyttet mod lys, men efterlades ved stuetemperatur, falder dens stabilitet til 2 eller 3 uger, men udsættes for direkte lys er forringelsen meget hurtig. Hvis du vil opbevare meget længere, kan det køles ved -20 ° C fordelt i portioner.

Basis

Denne farvning er baseret på generering af et nukleart forsænk i de vigtigste molekylærbiologiske teknikker, såsom: flowcytometri, fluorescensmikroskopi og farvning af metafasekromosomer eller mellemfase-kerner.

Denne teknik er baseret på den store affinitet, som farvestoffet har for de nitrogenholdige baser (adenin og thymin) indeholdt i det genetiske materiale (DNA) i den mindre rille. Mens det på cytoplasmatisk niveau efterlader det meget lidt baggrund.

Når det fluorescerende farvestof binder til adenin- og thyminregionerne i DNA, forøges fluorescensen markant (20 gange mere). Den farve, den udsender, er lys blå. Det bemærkes, at der ikke er nogen fluorescensemission, når der bindes til GC (guanin-cytosin) basepar.

Det er vigtigt at bemærke, at selv om det også har en affinitet for RNA, skaber dette ikke et problem, fordi den højeste grad af energiemission fra dette molekyle forekommer ved en anden bølgelængde (500 nm), i modsætning til DNA, der gør det ved 460 nm. Endvidere er stigningen i fluorescens, når den først er bundet til RNA, kun 20%.

DAPI bruges mere til at plette døde (faste) celler end levende celler, da der er behov for en meget højere koncentration af farvestoffet for at plette sidstnævnte, dette er fordi cellemembranen er meget mindre permeabel for DAPI, når den er i live.

DAPI-farvestof kan bruges i kombination med røde og grønne fluoroforer til en oplevelse i flere farver.

Brug

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) er en fremragende fluorofor og er derfor vidt brugt i forskellige teknikker og til forskellige formål. I det følgende forklares brugen af ​​DAPI i de vigtigste teknikker.

Flowcytometri

Forskerne Gohde, Schumann og Zante i 1978 var de første til at bruge og foreslå DAPI som en fluorofor i flowcytometri-teknikken og havde stor succes på grund af dens høje følsomhed over for DNA og dens høje intensitet i fluorescensemission.

Anvendelsen af ​​DAPI i denne teknik tillader undersøgelse af cellecyklus, kvantificering af celler og farvning af levende og døde celler.

Selvom der er andre farvestoffer, såsom ethidiumbromid, Hoechstoxid, acridin orange og propidiumiodid, er DAPI et af de mest anvendte, fordi det er mere fotostabelt end dem, der tidligere er nævnt.

Til denne teknik er det påkrævet at fikse cellerne, for dette kan der anvendes absolut ethanol eller 4% paraformaldehyd. Prøven centrifugeres, og supernatanten kasseres, derefter cellerne hydratiseres ved tilsætning af 5 ml PBS-puffer i 15 minutter.

Mens tiden går, skal DAPI-farven klargøres med en farvningsbuffer (FOXP3 fra BioLegend) i en koncentration på 3 uM.

Centrifuger prøven, kasser supernatanten, og dæk derefter med 1 ml DAPI-opløsning i 15 minutter ved stuetemperatur.

Tag prøven til flowcytometeret med den relevante laser.

Flow Microfluorometry

En anden teknik, hvor DAPI anvendes, er i strømningsmikro-fluorometri sammen med en anden fluorofor kaldet mithramycin. Begge er nyttige til kvantificering af chloroplast-DNA individuelt, men DAPI er bedst egnet til måling af T4-bakteriofagpartikler.

Hybridisering

Denne teknik bruger grundlæggende DNA-prober mærket med et fluorescerende farvestof, der kan være DAPI.

Prøven kræver varmebehandling for at denaturere det dobbeltstrengede DNA og omdanne det til to enkeltstrengede strenge. Den hybridiseres derefter med en DAPI-mærket denatureret DNA-sonde, der har en sekvens af interesse.

Senere vaskes det for at eliminere, hvad der ikke blev hybridiseret, en kontrast bruges til at visualisere DNA'et. Fluorescensmikroskop tillader observation af den hybridiserede probe.

Denne teknik har til formål at detektere specifikke sekvenser i kromosomalt DNA og være i stand til at stille diagnosen af ​​visse sygdomme.

Disse cyto-molekylære teknikker har været til stor hjælp til at bestemme detaljer i undersøgelsen af ​​karyotyper. For eksempel har han vist de baseparrige rige regioner af adenosin og thymin kaldet heterokromatiske regioner eller DAPI-bånd.

Denne teknik er vidt brugt til undersøgelse af kromosomer og kromatin i planter og dyr samt til diagnose af prenatal og hæmatologisk patologi hos mennesker.

I denne teknik er den anbefalede DAPI-koncentration 150 ng / ml i et tidsrum på 15 minutter.

Samlede slides skal opbevares beskyttet mod lys ved 2-8 ° C.

Immunofluorescensfarvning

Cellerne fikseres med 4% paraformaldehyd. Hvis der skal anvendes andre pletter, efterlades DAPI i slutningen som et forsænk, og cellerne dækkes med PBS-opløsning i 15 minutter. Mens tiden går, forbered DAPI-opløsningen ved at fortynde med PBS, således at den endelige koncentration er 300 uM.

Derefter fjernes overskydende PBS og dækkes med DAPI i 5 minutter. Vaskes flere gange. Objektglasset ses under et fluorescensmikroskop under det passende filter.

Sikkerhedsark

Denne forbindelse skal håndteres med omhu, fordi det er en forbindelse, der har mutagene egenskaber. Aktivt kul anvendes til at eliminere denne forbindelse fra vandige opløsninger, der skal kasseres.

Handsker, kjole og sikkerhedsbriller skal bruges for at undgå ulykker med dette reagens. Hvis der opstår kontakt med hud eller slimhinde, skal området vaskes med nok vand.

Du bør aldrig pipette dette reagens gennem munden, brug pipetter.

Forurener ikke reagenset med mikrobielle stoffer, da dette vil føre til forkerte resultater.

Fortynd ikke DAPI-pletten mere end anbefalet, da det reducerer plettenes kvalitet markant.

Udsæt ikke reagenset for direkte lys, eller hold det varmt, da dette reducerer fluorescensen.

Referencer

1. Brammer S, Toniazzo C og Poersch L. Corantes ofte involveret i plantecytogenetik. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Tilgængelig fra: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. Fås på: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratories. 2019. Brugsanvisning til DAPI. tilgængelig på cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Begreber og teknikker inden for flodøkologi. (2009). Redaktionel Rubes, Spanien. Tilgængelig på: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Brug af fluorescens i en modificeret dissektormetode til at estimere antallet af myocytter i hjertevæv. Arch. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Fås fra: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Tilstedeværelse af fytoplasmer i papaya (Carica papaya) i Mexico. Chapingo Magazine. Havebrugsserier, 2011; 17 (1), 47-50. Fås på: scielo.org.