BAKTERIEL UDSTRYGNING: EGENSKABER OG KLARGØRING - BIOLOGI - 2025

Den bakterielle smear er en tynd film udstrygning af en suspension af bakterielle mikroorganismer, der er lavet på en transparent glasplade eller glide, til observation under et lysmikroskop.

Forlængelsen i form af en film udføres for at adskille mikroorganismerne så meget som muligt, eftersom observationen ikke er klar, hvis de er grupperet.

Figur 1. Bakteriel udstødning set under et scanningselektronmikroskop. Kilde: pixbay.com

I studiet af bakteriekulturer bruges teknikker til udstrygning, fiksering og farvning til bedre analyse af dem. På grund af den lille størrelse af mikroorganismer er brug af et optisk mikroskop nødvendigvis nødvendigt for deres observation.

Optiske mikroskoper er vigtige instrumenter til at observere udstrygninger. Disse anvender optiske linser og lys, der gør det muligt at se prøverne med høj forstørrelse.

Generelt har levende celler stort set ikke farvede strukturer, set med lysmikroskopet er de farveløse, gennemsigtige prøver, og de viser meget lidt intern kontrast og med deres miljø.

Observation med det enkle lysfelt-optiske mikroskop uden brug af hjælpefarvningsteknikker er meget begrænset og bruges kun i nogle tilfælde, såsom til observation af bevægelsen af ​​mikroorganismer.

For optimal observation af mikroorganismer skal der skabes en balance mellem kontrast og opløsning. Celledetaljer kan ikke ses under et mikroskop, selv med høj opløsning; Brug af farvestoffer kræves ved farvningsteknikker, der giver kontrast til observation.

Karakteristika ved bakteriesmuds af god kvalitet

Fremragende kontrast

For at opnå fremragende kontrast er der sofistikerede mikroskoper kaldet fasekontrastmikroskoper, differentielle interferensmikroskoper og mørke feltmikroskoper. Denne type mikroskop bruges til at observere blandt andet bakterielle strukturer såsom hylster og filamenter.

Farvning er en enkel teknik til at øge kontrasten, der opnås med et lysfeltmikroskop. I denne teknik kan forskellige pletter anvendes, hvilket markant forbedrer mikroskopisk observation.

Pletterne udføres direkte på udstrygninger eller udvidelser af mikroorganismesuspensionerne på objektglasene, der tidligere blev tørret og fikseret.

God løsning

Fixering er en teknik, der bruges til at bevare cellestrukturer; forårsager inaktivering af mikroorganismer og vedhæftning til objektglassets glas. Der er forskellige fastgørelsesbehandlinger: varmefiksering og kemisk fiksering.

Varmefiksering

Dette er den mest anvendte metode til observation af bakteriespræning. Teknikken består af at føre bakteriesuspensionen af ​​udstrygningen gennem en lightere. Denne teknik er i stand til at bevare den eksterne morfologi af bakterier, men ødelægger deres indre strukturer.

Kemisk fiksering

Kemisk fiksering anvender konserveringskemikalier, såsom formaldehyd eller formalin, ethanol og eddikesyre, blandt andre. Fordelen ved at anvende kemiske fikseringsmidler er, at bevarelsen af ​​de indre cellulære strukturer i mikroorganismerne opnås.

Figur 2. Blodudtværing. Kilde: Bobjgalindo, fra Wikimedia Commons

God farvning

De mest almindelige procedurer til farvning af en tidligere tørret og fast udstrygning er positiv eller enkel farvning, differentiel farvning og negativ farvning. Der er også specielle teknikker til farvning af bestemte cellestrukturer (kapsel, spore, flagella).

Positiv farvning eller simpel farvning

Positiv eller simpel farvning er den mest udbredte teknik til udstrygningsfarvning. Det bruger farvestoffer, der har evnen til at binde sig til bestemte mikrobielle strukturer, så de kan observeres under et mikroskop.

Disse farvestoffer har kromoforegrupper (farvet del) i deres kemiske struktur med vekslende dobbeltbindinger og enkeltbindinger (konjugering). Disse bindinger kan igen etablere ioniske eller kovalente bindinger med nogle cellulære strukturer.

De farvestoffer, der anvendes ved positiv eller simpel farvning, er for det meste kemiske derivater af anilin (farvede organiske salte).

På den anden side kan vi blandt farvestofferne finde nogle med en basisk pH og andre med en sur pH.

Grundlæggende farvestoffer

I basiske farvestoffer har kromoforegruppen en positiv elektrisk ladning. Langt de fleste af de prokaryote mikroorganismer har en neutral intern pH-værdi, og deres celleoverflade er negativt ladet. Gennem denne elektrostatiske interaktion binder kromoforen sig til cellen og pletter den.

Eksempler på basiske farvestoffer er blandt andet methylenblå, krystalviolet, malachitgrøn, basisk fuscin, safranin.

Syrefarvestoffer

I syrefarvestoffer har kromoforegruppen en negativ elektrisk ladning. Disse bruges til at plette proteiner med positivt ladede aminogrupper. Eksempler på syrefarvestoffer er sur fuscin, rose Bengal, Congo rød og eosin.

Forskellig farvning

Den differentielle farvningsteknik består af at anvende to farvestoffer med forskellig farve eller intensitet for at skelne forskellige mikroorganismer under mikroskopet. Gramfarven og syre-alkoholresistensfarven er de mest almindeligt anvendte differentielle pletter i bakteriologi.

Gram-pletten bruges som en indledende test for at kende form, størrelse, cellegruppering samt type cellevæg. Ved hjælp af Gram-farvetesten klassificeres cellevægsbakterier i Gram-positive bakterier og Gram-negative bakterier.

Negativ farvning

I denne teknik anvendes kemiske farvestoffer, der ikke trænger ind i det indre af cellen, men som gør mediet, hvori mikroorganismerne er, vises som en sort baggrund.

Ved den negative farvningsteknik fremstilles udstrygningen med en dråbe indisk blæk- eller nigrosinsuspension, som efter tilladelse til tørring ved stuetemperatur danner en uigennemsigtig film til lysets passage. På denne måde vises mikroorganismer som lyse former på en mørk baggrund.

Forberedelse

A. Udtværning

1.- Vask objektglassene meget godt, tør med absorberende papir og mærk dem. Etiketten skal angive indholdet af præparatet, datoen og navnet på den person, der behandlede det.

2.- Tænd lighteren og steriliser inokulationssløjfen i flammen, indtil den er rød rød.

3.- Lad håndtaget køle af.

4.- Tag bakteriekulturrøret, fjern hætten og før hurtigt rørens munding nær brænderflammen (flammen).

5.- Indsæt inokulationssløjfen i røret, der indeholder bakteriekulturen, og tag prøven.

6.- Hvis kulturen er i flydende medium, placeres prøven taget med håndtaget i midten af ​​objektglasset og spred den forsigtigt i en cirkel på cirka 2 cm i diameter.

7.- Steriliser inokulationssløjfen igen.

8.- Lad udstrygningen tørre i luften.

9.- Gentag trin 3 til 8 tre gange.

10.- Hvis kulturen er i fast medium, skal en dråbe destilleret vand tidligere placeres på objektglasset. Dette gøres for at blande en lille prøve af kulturen taget med inokulationssløjfen som anført i trin 2 til 5 (aseptiske betingelser).

11.- Spred den fortyndede prøve med dråben vand på objektglaset og gentag tre gange.

B. Fixering

1.- Tilsæt to dråber methanol eller absolut ethanol til de tørre udstrygninger - fra kulturer i flydende medium -.

2.- Lad lufttørring væk fra lighteren.

3.- Hvis udstrygningen kommer fra en kultur i fast medium, fastgøres den tørre udstrygning med varme, og den føres 2 til 3 gange hurtigt gennem den varmeste del af den lysere flamme.

4.- Rør ved den nedre del af udstrygningen med den venstre side af ryggen (til højrehåndtere; ellers skal du bruge højre hånd) og kontrollere, at det er koldt.

C. Simpel farvning

1.- Tilsæt 2 dråber af den valgte plet til udstrygningen og lad det virke i den krævede tid i de specifikke protokoller for hver plet (normalt mellem 1 og 5 minutter).

2.- Nogle pletter kræver brug af varme til aktivering af dem, i hvilket tilfælde er det nødvendigt at være meget forsigtig, når du opvarmer objektglasset i den lysere flamme (manipulér den med en pincet og undgå kogning). Overophedning af udstrygningen kan ødelægge de celler, der skal observeres.

3.- Fjern overskydende farvestof ved at vaske med destilleret vand fra en picette. Fjern vaskevandet ved forsigtigt at tappe på objektglaset på kanten, vippet på arbejdsbordet.

4.- Tillad lufttørring.

5.- Afhængig af observationstypen bruges eller ikke et dækglas på dette trin. Coverlip beskytter og bevarer udstrygningen. Hvis der foretages en olie-nedsænkningsobservation på dette tidspunkt, anvendes der ikke dækglas, men udstrygningen kan ikke bevares.

D. Definitiv konservering af udstrygningen

1.- Sænk udstrygningen successivt i hver af de nedenfor anførte opløsninger i mindst 5 minutter. Formålet med disse "bade" er at udtørre udstødningen fuldstændigt. Hvert reagens skal tappes grundigt, inden smøremålet indføres i det næste bad.

Rækkefølgen af ​​de dehydratiserende bade er som følger:

1. Ethanol 70%
2. Ethanol 95%
3. Ren acetone
4. Aceton-xylol 1: 1-blanding
5. xylen

Lad derefter lufttørre.

2.- Monter dækslet, fortrinsvis 22 × 22 mm, ved hjælp af Canada balsam eller andet monteringsmedium.

Referencer

1. Briggs, G. (1965). Årsagsfaktorer i mikrobiologiske laboratorieulykker og infektioner. US Army Biologiske Laboratorier. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG og Welch, CT (2017). Mikrobiologi: En laboratorievejledning. Pearson.
3. Holt, JG Editor. (1977). Den kortere Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 8 ^th Baltimore: Williams and Wilkins Co.
4. Johnson, TR og Case; CL (2018). Laboratorieeksperimenter i mikrobiologi. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostisk mikrobiologi. 14 ^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.