TSI AGAR: BEGRUNDELSE, FORBEREDELSE OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den TSI agar eller tredobbelt sukker-jern-agar er et fast medium, der tjener som en biokemisk test til at guide den indledende identifikation af gramnegative baciller. Det er baseret på at vise gæringen af ​​de tilstedeværende sukkerarter og produktionen af ​​hydrogensulfid og gas.

Dets sammensætning og basis ligner meget Kligler-jerntesten med den forskel, at sidstnævnte kun indeholder glukose og lactose. I stedet, som navnet antyder, indeholder triple sukkerjernagar tre gærbare kulhydrater: glukose, laktose og saccharose.

Billeder af TSI-testen med forskellige mikroorganismer A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Kilde: Witmadrid, fra Wikimedia Commons

Derudover har TSI-mediet fire proteinderivater, der gør det til en meget nærende agar: gærekstrakt, kødekstrakt, pepton og proteose pepton. Det indeholder også jernholdigt ammoniumsulfat, natriumthiosulfat, natriumchlorid, fenolrødt og agar.

En mikroorganismes manglende evne til at fermentere glukosen, der er til stede i mediet, udelukker straks den fra at tilhøre Enterobacteriaceae-familien. Derfor er denne test afgørende for at beslutte, hvilken identifikationsrute der skal køres for at bestemme slægt og art.

Hvert laboratorium beslutter, om det skal arbejde med TSI-agar eller med Kligler-jernagar.

Basis

Hver af forbindelserne udfører en funktion inden for mediet.

Natriumchlorid og agar

Natriumchlorid er nødvendigt for at opretholde den osmotiske balance i mediet. Mens agaren giver den faste konsistens.

PH-indikator (phenol rød)

PH i det forberedte medium er afbalanceret ved 7,3, og pH-indikatoren (phenolrød) bliver gul under 6,8. Dette betyder, at små mængder syrer, der er produceret ved gæring af sukker, vil gøre mediet fra rød-orange til gult.

Hvis der ikke sker nogen gæring, sker der alkalisering af mediet gennem brug af peptoner, hvorved der bliver rød-orange til stærk rød.

Proteinderivater (gærekstrakt, kødekstrakt, pepton og proteose pepton)

Når bakterier metaboliserer de proteiner, der er til stede i TSI-agar, produceres aminer, der alkaliserer mediet (hovedsageligt på skråt niveau), fordi reaktionen kræver ilt. Aminerne gør rammen lyserød.

Men dette afhænger af bakteriens evne til at fermentere kulhydrater eller ej.

Fermentering af kulhydrater (glukose, lactose og saccharose)

Undersøgelsen af ​​gæring af sukkerarter kan give flere billeder, og hver enkelt fortolkes forskelligt. Testtolkningen opdeler mikroorganismer i 3 kategorier: ikke-fermenteringsmidler i glukose, ikke-fermenteringsmidler i lactose og lactose / sucrose-fermentorer.

Det skal bemærkes, at mængden af ​​glukose i mediet er begrænset, medens koncentrationen af ​​lactose og saccharose er 10 gange højere.

Bakterier fra Enterobacteriaceae-familien og andre glukosegærende mikroorganismer vil begynde at fermentere dette sukker, da det er det enkleste kulhydrat til energi.

På den anden side er lactose og saccharose komplekse kulhydrater, der skal nedbrydes og omdannes til glukose for at de kan komme ind i Embden-Meyerhof cyklus.

-Mikroorganismer, der ikke fermenterer glukose

Når den inokulerede mikroorganisme ikke er i stand til at fermentere glukose, vil meget mindre være i stand til at fermentere andre kulhydrater. Derfor dannes der ingen syrer her, men der dannes aminer i skråningen ved anvendelse af peptoner.

I dette tilfælde drejes rammen til en stærkere rød, og rørets bund kan forblive uændret, eller den kan også være alkaliseret, hvilket giver hele røret rødt.

Tolkning: K / K betyder alkalisk skrå / alkalisk eller neutral bund

På billedet i begyndelsen af ​​artiklen se billedet af rør D.

Dette resultat indikerer, at mikroorganismen ikke hører til Enterobacteriaceae-familien.

-Mikroorganismer, der ikke fermenterer lactose / saccharose

Hvis bakterierne er i stand til at fermentere glukose, men ikke lactose eller saccharose, vil følgende ske:

Bakterierne vil forbruge al den tilstedeværende glukose efter ca. 6 til 8 timer, og være i stand til at forsure både skrå og blokerende; det vil sige, agaren vil være blevet helt gul. Men når glukose er udtømt og lactose og saccharose ikke kan bruges, vil bakterierne begynde metabolismen af ​​proteiner.

Denne reaktion har brug for ilt, derfor forekommer nedbrydning af peptoner på overfladen (skråkant). Aminerne produceret alkaliserer rammen med guling til rød. Denne reaktion påvises efter 18 til 24 timers inkubation.

Tolkning: K / A betyder alkalisk skråkant og syrevæv.

På billedet i begyndelsen af ​​artiklen se billedet af rør B.

-Lactose / sucrose-fermenterende mikroorganismer

Mikroorganismer, der er i stand til at fermentere lactose og saccharose, kan naturligvis fermentere glukose. Efter at den minimale mængde glucose, der er til stede i mediet, er udtømt, begynder det dannede pyruvat at metaboliseres til dannelse af syrer gennem den aerobe Krebs-cyklus, og i tidsrummet fra 8 til 12 timer vil alt mediet være gult.

Hvis bakterierne er i stand til at nedbryde laktose eller saccharose, fortsætter syrer med at blive produceret, og efter 18 til 24 timer vil hele røret - affasning og prop - fortsætte med at gulne.

Det skal bemærkes, at anvendelsen af ​​glukose udføres på to måder: den ene aerobt ved rørets skrå kant og den anden anaerobt i bunden af ​​røret.

Tolkning: A / A betyder syre skrå / syre bund. Det har muligvis ikke gas.

På billedet i begyndelsen af ​​artiklen se billedet af rør A.

Gasproduktion

Nogle mikroorganismer er i stand til at producere gas under fermenteringen af ​​sukkerarter. Gassen er påvist i røret af det tryk, den udøver i agaren. Tryk forårsager boble dannelse eller forskydning af agaren. Undertiden kan dannelsen af ​​gas brudde mediet.

Det er vigtigt, at når podningen af ​​TSI-mediet, udføres punkteringen rent gennem midten af ​​agaren, indtil den når bunden. Hvis punkteringen omdirigeres mod rørets vægge, kan det forårsage falske positiver i gasproduktionen, da den slipper ud gennem den forkert dannede kanal.

Gasproduktionen såvel som reaktionerne, der forekommer i agarskråningen, har brug for ilt, derfor anbefales det, at røret er dækket med en bomuldsprop, og hvis der bruges et Bakelite-låg, bør det ikke være helt tæt.

Gasproduktion rapporteres som positiv (+) eller negativ (-).

Gasdannelsesmønstre. Kilde: Skema foretaget af MSc. Marielsa Gil. Billedkilde: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, via Wikimedia Commons

Natriumthiosulfat og jernholdigt ammoniumsulfat

Bakterier, der er i stand til at producere hydrogensulfid (farveløs gas), optager svovlet fra natriumthiosulfat til stede i mediet. Når H ₂ S dannes, reagerer det med ferroammoniumsulfat, der producerer jernsulfid (klart synlige sorte bundfald).

H ₂ S-produktion rapporteres som positiv (+) eller negativ (-).

På billedet i begyndelsen af ​​artiklen se billedet af rør C.

Forberedelse

Vej 62,5 g af det dehydratiserede triple sukkerjernagar (TSI) -medium og opløst i en liter destilleret vand.

Opvarm, indtil agaren er helt opløst. Kog et minut under omrøring ofte. Fordel 4 ml af mediet i 13/100 reagensglas med bomuldshætter.

Steriliser i en autoklav ved 121 ° C i 15 minutter. Fjern det fra autoklaven, og lad det hvile i en vinkel. Sørg for, at både basen og rammen har den samme afstand.

Opbevares i køleskab 2-8 ° C. Lad det varme op, inden bakteriestammen sås.

Farven på det dehydrerede medium er lys beige, og det tilberedte medium er rød-orange.

Det endelige pH for det fremstillede medium er 7,3 ± 0,2.

Applikationer

TSI-testen er vidt brugt på mikrobiologisk laboratorieniveau. Denne test er vigtig for at guide den type test, der skal anvendes for at identificere slægten og arten. Dens gode udførelse og fortolkning kan redde materiale og arbejde.

Hvis resultatet er en TSI K / K, og cytochrome oxidasetesten er positiv, er det kendt, at test skal anvendes til identifikation af ikke-gærende Gram-negative stænger, såsom Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, blandt andre slægter. Hvis det er oxidase-negativt, er det orienteret mod slægterne Acinetobacter, Stenotrophomonas osv.

På den anden side, hvis en TSI A / A eller K / A opnås, og cytochrome oxidasetesten er negativ, jo mere nitrater reduceres til nitriter, vil vi være sikre på, at det er en mikroorganisme, der tilhører Enterobacteriaceae-familien. I dette tilfælde vil identifikationsvejen fokusere på specifikke test for denne gruppe af bakterier.

På den anden side, hvis der opnås et K / A- eller A / A-billede, og cytochrome oxidasetesten er positiv, vil de yderligere test, der skal samles, være rettet mod identifikation af fermenteringsstammer, der ikke hører til Enterobacteriaceae-familien, såsom: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio og Pasteurella.

En TSI med hydrogensulfid, oxidase-negativ, vil lede identifikationen af ​​følgende slægter af familien Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella eller Salmonella.

En TSI med lille eller moderat hydrogensulfid i det alkaliske bevel med en alkalisk baggrund og en positiv oxidase vil guide anvendelse af test til identifikation af ikke-fermenterende H ₂ S- producerende gram-negative stave, såsom Shewanella putrefaciens.

Endelig kan TSI'en bruges til undersøgelse af hydrogensulfidproduktion i Gram-positive baciller, især når der er mistanke om Erysipelothrix rhusiopathiae.

sået

TSI-mediet skal inokuleres med rene kolonier, isoleret i primære eller selektive kulturer. Hvis kolonien er taget fra selektive medier, der blev podet med prøver med blandet flora, skal man sørge for kun at tage fra overfladen, da levedygtige stammer hæmmet i dette medium kan eksistere i den nedre del af kolonien.

Derfor bør sløjfen aldrig afkøles på selektivt medium, hvorefter kolonien optages og inokuleres med TSI-medium.

Såingen udføres med en lige sløjfe eller nål. Der udføres en punktering, idet du sørger for, at den er gennem midten af ​​midten, indtil den når bunden, og så er såingen færdig ved at inokulere overfladen i en zigzagform. Foretag ikke to punkteringer.

Inkuber ved 37 ° C i aerobiose i 18-24 timer. Fortolk på dette tidspunkt hverken før eller efter.

Begrænsninger

TSI-testen skal læses inden for 18 til 24 timer efter inkubationen. En læsning før dette tidspunkt kan give en falsk positiv for A / A-gæring. I mellemtiden kan en aflæsning efter dette tidspunkt give anledning til et falskt negativt billede af en ikke-gæring, på grund af forbruget af peptoner, der alkaliserer mediet.

Referencer

1. Mac Faddin J. (2003). Biokemiske test til identifikation af bakterier af klinisk betydning. 3. udg. Redaktionel Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
4. "TSI-agar." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 10 jul. 2018, 08:09 UTC. 10. februar 2019, 03:33 Tilgængelig på: es.wikipedia.org
5. Britannia Laboratories. TSI Agar (Triple sukkerjernagar). 2015. Tilgængelig på: britanialab.com
6. BD Laboratories. Triple sukkerjernagar (TSI Agar). 2003. Tilgængelig på: bd.com