HØJTYDENDE VÆSKEKROMATOGRAFI (HPLC): RATIONALE, UDSTYR, TYPER - KEMI - 2025

Den højtydende væskekromatografi er en instrumentel teknik, der bruges i kemiske analyser, hvor separate blandinger er tilladt, oprensning og kvantificering af dets komponenter og yderligere undersøgelser. Det er kendt ved forkortelsen HPLC, afledt af engelsk: High Performance Liquid Chromatography.

Som navnet antyder fungerer det således ved at manipulere væsker. Disse består af en blanding sammensat af analytten eller prøven af ​​interesse og et eller flere opløsningsmidler, der fungerer som den mobile fase; det vil sige den, der trækker analytten gennem alt HPLC-udstyr og kolonnen.

HPLC-udstyr. Kilde: Dqwyy

HPLC bruges i vid udstrækning af laboratorier for kvalitetsanalyse i mange virksomheder; såsom farmaceutiske stoffer og fødevarer. Den pågældende analytiker skal forberede prøven, den mobile fase, kontrollere temperaturen og andre parametre og placere hætteglassene inde i hjulet eller karrusellen for, at udstyret kan udføre injektionerne automatisk.

HPLC-udstyret er koblet til en computer, gennem hvilket de genererede kromatogrammer kan observeres, såvel som for at starte analyserne, kontrollere strømningshastigheden for den mobile fase, programmere typen af ​​eluering (isokratisk eller gradient) og tænde for detektorerne (UV -Vis eller massespektrofotometer).

Basis

I modsætning til konventionel væskekromatografi, såsom papir- eller silicagelfyldt søjlekromatografi, afhænger HPLC ikke af tyngdekraften for væsken til at fugtige den stationære fase. I stedet fungerer det med højtrykspumper, der irrigerer mobilfasen eller eluenten gennem søjlen med større intensitet.

På denne måde er det ikke nødvendigt at hælde mobilfasen så ofte gennem søjlen, men snarere gør systemet det kontinuerligt og med højere strømningshastigheder.

Men effektiviteten af ​​denne teknik skyldes ikke kun denne detalje, men også de små fyldstofpartikler, der udgør den stationære fase. Når det er mindre, er dens kontaktområde med den mobile fase større, så det vil interagere bedre med analytten, og dens molekyler vil adskille mere.

Disse to egenskaber plus det faktum, at teknikken tillader kobling af detektorer, gør HPLC langt bedre end tyndt lag eller papirchromatografi. Adskillelser er mere effektive, den mobile fase bevæger sig bedre gennem den stationære fase, og kromatogrammer kan registrere enhver fejl i analysen.

Udstyr

Forenklet diagram over driften af ​​et HPLC-udstyr. Kilde: Gabriel Bolívar.

Ovenfor er et forenklet diagram over, hvordan et HPLC-udstyr fungerer. Opløsningsmidlerne er i deres respektive containere, arrangeret med slanger, så pumpen fører et lille volumen af ​​dem ind i udstyret; vi har således den mobile fase.

Den mobile fase eller eluenten skal først afgasses, så boblerne ikke påvirker adskillelsen af ​​analytmolekylerne, som blandes med den mobile fase, når udstyret har foretaget injektionerne.

Den kromatografiske søjle er placeret inde i en ovn, der gør det muligt at regulere temperaturen. For forskellige prøver er der således tilstrækkelige temperaturer til at opnå adskillelser med høj ydeevne såvel som et bredt katalog over søjler og typer fyld eller stationære faser til specifik analyse.

Den mobile fase med den opløste analyt kommer ind i søjlen, og derfra elueres molekylerne, der "føler" mindre affinitet for den stationære fase, mens de, der er mere tilbageholdt af den, eluerer senere. Hvert elueret molekyle genererer et signal, der vises på kromatogrammet, hvor retentionstiderne for de adskilte molekyler observeres.

Og på den anden side ender mobilfasen efter passering gennem detektoren i en affaldsbeholder.

HPLC-typer

Der er mange typer HPLC, men blandt dem alle er de mest fremragende de følgende fire.

Normal fase kromatografi

Normal fase-kromatografi henviser til en, hvor den stationære fase er polær, mens den mobile fase er ikke-polær. Selvom det kaldes normalt, er det faktisk det mindst anvendte, idet den omvendte fase er den mest udbredte og effektive.

Omvendt fase kromatografi

At være en invers fase, nu er den stationære fase apolar og den mobile fase polar. Dette er især nyttigt i biokemisk analyse, da mange biomolekyler opløses bedre i vand og i polære opløsningsmidler.

Ionbytterkromatografi

I denne type kromatografi bevæger analytten sig med en positiv eller negativ ladning gennem søjlen og erstatter de ioner, den huser. Jo højere ladning, desto højere tilbageholdelse er det, hvorfor det bruges i vid udstrækning til at adskille ioniske komplekser af overgangsmetaller.

Størrelse ekskludering kromatografi

Denne kromatografi snarere end adskillelse er ansvarlig for at rense den resulterende blanding. Som navnet antyder, adskilles analytten ikke længere afhængigt af hvor tæt den er relateret til den stationære fase, men i henhold til dens størrelse og molekylmasse.

Mindre molekyler vil blive mere tilbageholdt end store molekyler, da sidstnævnte ikke er fanget mellem porerne i polymersøjlefyldningerne.

Applikationer

HPLC muliggør både kvalitativ og kvantitativ analyse. På den kvalitative side kan sammenligningen af ​​kromatogramretentionstiderne under visse betingelser detekteres tilstedeværelsen af ​​en bestemt forbindelse. En sådan tilstedeværelse kan være tegn på sygdom, forfalskning eller stofbrug.

Derfor er det en computerdel af diagnostiske laboratorier. Ligeledes findes det inden for farmaceutiske industrier, da det tillader at kontrollere produktets renhed såvel som dets kvalitet med hensyn til dets opløsning i gastrisk miljø. Udgangsmaterialer underkastes også HPLC for at rense dem og sikre bedre ydeevne i lægemiddelsyntesen.

HPLC tillader analyse og adskillelse af komplekse blandinger af proteiner, aminosyrer, kulhydrater, lipider, porfyriner, terpenoider og er i det væsentlige en fremragende mulighed for at arbejde med planteekstrakter.

Og endelig giver molekylær ekskluderingskromatografi dig mulighed for at vælge polymerer i forskellige størrelser, da nogle kan være mindre eller større end andre. På denne måde opnås produkter med lav eller høj gennemsnitlig molekylmasse, hvilket er en afgørende faktor for deres egenskaber og fremtidige anvendelser eller syntese.

Referencer

1. Day, R., & Underwood, A. (1989). Kvantitativ analytisk kemi. (femte udgave). PEARSON Prentice Hall.
2. Bussi Juan. (2007). Højtydende væskekromatografi.. Gendannes fra: fing.edu.uy
3. Wikipedia. (2019). Højtydende væskekromatografi. Gendannet fra: en.wikipedia.org
4. Clark Jim. (2007). Højtydende flydende kromatografi. Gendannes fra: chemguide.co.uk
5. Matthew Barkovich. (05. december 2019). Højtydende flydende kromatografi. Kemi LibreTexts. Gendannes fra: chem.libretexts.org
6. GP Thomas. (15. april 2013). High Performance Liquid Chromatography (HPLC) - Metoder, fordele og applikationer. Gendannes fra: azom.com