MAJ GRÜNWALD-GIEMSA-PLET: BEGRUNDELSE, TEKNIK OG ANVENDELSER - BIOLOGI - 2025

Den May Grunwald-Giemsa eller Pappenheim pletten er en differential farvningsteknik, der blander Giemsa og May Grünwald reagenser. Det bruges til differentiering af normale og unormale blodlegemer i perifert blod og knoglemarvsudstrygning samt til farvning af histologiske sektioner og cytologiske prøver.

Begge reagenser -Giemsa og May Grünwald- er afledt af Romanowsky-farvning, en teknik, der er baseret på kombinationen af ​​sure og basiske farvestoffer.

Udstrygning, der viser en segmenteret neutrofil og en milleocyt i tilfælde af kronisk myeloid leukæmi, farvet med May Grünwald Giemsa-pletten. Dr Ramon Simon-Lopez (https://es.m.wikipedia.org/wiki/Archivo:LMC-1.JPG) gennem Wikipedia.org.

Giemsa forbedrede teknikken ved at stabilisere blandingen af ​​eosin, methylenblå og deres derivater med glycerol. I stedet bruger May Grünwald eosin og methylenblå og bruger methanol som opløsningsmiddel. Denne strategiske kombination har givet fremragende resultater.

Selv om det med hensyn til observation af cellemorfologi fungerer på en lignende måde som Giemsa- og Wright-pletterne, forbedrer denne teknik de tidligere ved at raffinere farvning af parasitterne, der forårsager malaria, Chagas sygdom, leishmaniasis og trichomoniasis.

Derudover har det vist sig at være en meget nyttig teknik til den cytologiske undersøgelse af spermatisk væske. Det har skiller sig ud ikke kun ved at vise de morfologiske egenskaber ved sæd, men også ved at tillade differentiering af leukocytter, epitelceller og spermatogenese celler med stor effektivitet.

Basis

Teknikken følger grundlaget for Romanowsky-pletter, hvor sure farvestoffer har selektiv affinitet for basale cellulære komponenter, og sure komponenter tiltrækker basale pletter.

Forklaret på en anden måde har både cellestrukturer og farvestoffer positive eller negative elektriske ladninger; som afgifter frastøder og forskellige afgifter tiltrækker.

For eksempel er basiske farvestoffer som methylenblå positivt ladet og tiltrækkes af negativt ladede strukturer. Derfor farver dette farvestof de kerner, der er rige på DNA og RNA, der har negativt ladede fosfatgrupper.

Granulaterne af segmenterede basofiler og cytoplasmerne fra RNA-holdige mononukleære hvide blodlegemer er også farvede.

På lignende måde bærer syrefarvestoffet en negativ ladning, hvorfor det binder til positivt ladede strukturer såsom erythrocytter og granuler af segmenterede eosinofiler. Hvad angår granulaterne med segmenterede neutrofiler, fikserer disse begge farvestoffer.

Forskellige farvestoffer

I denne teknik eksisterer en kombination af reaktioner mellem ortokromatiske og metachromatiske farvestoffer sameksistent. Ortokromatika (eosin og methylenblå) binder til den cellestruktur, som de er relateret til og giver en stabil farve, der ikke varierer.

På den anden side varierer metachromaterne (derivaterne af methylenblå azurblå A og azurblå B) deres oprindelige farve, når de først er knyttet til den specifikke struktur, og der kan endda være forskellige farver.

Endelig kræver det trin, som May Grünwald-løsningen tager, tilstedeværelse af vand, da uden dette farvestof vil trænge ind i strukturer, men ikke fikseres. For at dette skal ske, skal farvestoffet blive polært eller ioniseres og således være i stand til at udfælde og binde til beslægtede strukturer.

Teknik

materialer

- Slides slides.

- Farvebroer.

- Maj-Grünwald-løsning.

- Giemsa-plet.

- Destilleret vand.

Kan Grünwald farve koncentreret opløsning

0,25 g eosin-methylenblåt (plet ifølge May Grünwald) skal vejes og opløses i 100 ml methanol. Derefter blandes præparatet i 1 time og lodes hvile i 24 timer. Ved afslutningen af ​​tiden filtreres det.

For at anvende teknikken skal May Grünwald-farvestoffet fortyndes som følger: for 200 ml fortyndet farvestof, mål 30 ml af den koncentrerede opløsning, tilsæt 20 ml bufferopløsning og 150 ml destilleret vand justeret til pH 7,2-7,3. Senere blandes og filtreres.

Giemsa pletkoncentrat

0,5 g azur-eosin-methylenblåt (plet ifølge Giemsa) skal vejes, opløses i 50 ml methanol og 50 ml glycerin tilsættes til blandingen.

For at udføre teknikken fortyndes 1:10 med bufferopløsning og lad den hvile i 10 minutter. Det kan filtreres om nødvendigt.

Fremstilling af bufferopløsningen ved pH 7,2

De bør vejes:

- 40 mg kalium-di-hydrogenphosphat (KH2PO4).

- 151 mg di-natriumhydrogenphosphat 12-hydrat (Na2HPO4).

Begge forbindelser opløses i 100 ml vand.

Procedure for farvning af plet ved blod eller knoglemarv

Der er to tilstande: en klassiker og en hurtig.

Klassisk tilstand

1. Dæk udstrygningen i 2 til 3 minutter med den fortyndede May-Grünwald-opløsning.
2. Vask med bufret destilleret vand for at fjerne den foregående opløsning.
3. Dæk med den samme bufrede vaskeopløsning og lad stå i 1 minut. Tanken er, at det forrige farvestof er fastgjort til strukturerne, og at cellerne samtidig hydratiseres.
4. Tilsæt 12 dråber fortyndet Giemsa-tinktur til det bufrede vand og blæse for at blande og homogenisere. Lad det hvile i 15 til 20 minutter.
5. Vask udstrygning med bufret destilleret vand og sted til lufttørre.
6. Fokuser og se de farvede blodlegemer under et lysmikroskop ved hjælp af 40X-målet. Om nødvendigt kan 100X bruges.

Hurtig tilstand

1. Dæk udstrygningen med fortyndet May Grünwald-plet i 1 minut.
2. Vask med bufret destilleret vand.
3. Dæk med bufret vand, og lad det hvile i 1 minut.
4. Tilsæt den fortyndede Giemsa-plet, og lad den stå i 5 minutter.
5. Vask med bufret destilleret vand og lad det lufttørre.

De her beskrevne teknikker er en retningslinje, men det skal tages i betragtning, at procedurerne og farvningstiderne varierer afhængigt af det kommercielle firma, der distribuerer reagenserne. Det anbefales at følge de trin, der er strengt angivet af hvert kommercielt hus.

Teknik til farvning af udstrygning af spermatisk væske

1- Dæk udtværingen med et tyndt lag af May Grünwald-opløsningen i 4 minutter.

2- Fjern farvestoffet og vask med destilleret vand.

3- Anbring et lag fortyndet Giemsa (1:10) i destilleret vand i 15 minutter.

4- Fjern farvestoffet og vask med destilleret vand.

5- Lad tørre og observer under mikroskopet.

Forventede farver med May Grünwald Giemsa-pletten

Vigtige specifikationer

Teknikken kræver, at reagenserne og vaskeopløsningerne har en pH-værdi, der er indstillet til 7,2 -7,3, så affiniteterne af farvestofferne for de cellulære strukturer ikke forvrides, og den forventede endelige farve ikke varierer.

Applikationer

Denne teknik bruges af kliniske laboratorier til at plette perifert blod og knoglemarvsudstrygning, vævsektioner og cytologier.

På det hæmatologiske felt er denne teknik af vital betydning i undersøgelsen af ​​cellernes abnormiteter med hensyn til form, størrelse og antal. Det er et meget værdifuldt værktøj til diagnose af visse sygdomme, såsom leukæmier og anæmi.

Derudover er det yderst nyttigt, når man søger parasitter i de hæmatologiske (Plasmodium sp og Trypanosoma cruzi) eller histologiske (Leishmanias sp) områder.

Vaginal cytologi

Med hensyn til vaginalcytologi er denne teknik især fordelagtig til observation af Trichomonas vaginalis. Dette er et vigtigt fund, da dens tilstedeværelse simulerer karcinom in situ-billeder, der senere forsvinder, når parasitten fjernes.

Sædprøve

Det har været et ideelt værktøj til undersøgelse af sædprøver, da det giver værdifuld information om sædkvaliteten.

De data, den tilbyder, har hovedsageligt at gøre med antal og morfologi såvel som med de samtidige celler, der kan være til stede, og som er af vital betydning, såsom kimceller, leukocytter og epitelceller.

Med denne analyse er det muligt at beskrive abnormiteter observeret i sædcellerne i hovedet, nakken, midtstykket og hovedstykket.

Derudover kan de også hjælpe med at vise tilfælde af hæmospermi (tilstedeværelse af røde blodlegemer i sæden) og leukospermi eller piospermi (stigning i antallet af leukocytter i sæden).

Referencer

1. Costamagna S, Prado M. Validering af den friske test, May Grünwald-Giemsa og Gram-pletter og kulturmedier til diagnose af Trichomonas vaginalis. Parasitol. 2001; 25 (1-2): 60-64. Fås i: scielo.
2. Merck KGaA Laboratory. Maj Grünwald eosin methylenblå til mikroskopi.
3. "May-Grünwald-Giemsa-plet." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 15. nov. 2018, 14:37 UTC. 8. januar 2019, 04:29: da.wikipedia.org
4. Glas kemikalier Panreac Laboratory. Reagenser til histologiske teknikker, hæmatologi og mikrobiologi. Fås på: glasschemicals.com
5. Retamales E, Manzo V. Anbefaling til farvning af blodudstrygning for at læse hæmogrammet. National og reference biomedicinsk laboratorium. Institut for folkesundhed i Chile.
6. Sarabia L. Spermiogram ifølge WHO-kriterier. Udviklingsanatomi og biologi-program. Skolen for medicin. University of Chile. Fås på: pp.centramerica.com