Den agar Simmons citrat det er et fast medium anvendes som biokemiske identifikation forsøgsmikroorganismer, især gram - negative bacilli. Det originale medium blev skabt af Koser i 1923.
Koser Citrat-medium bestod af en bouillon indeholdende natriumphosphat, ammoniumphosphat, monopotassiumphosphat, magnesiumsulfat og natriumcitrat.
A. Dehydreret Simmons Citrat Agar kommercielt medium B. Fremstillet Simmons Citrat Agar. Kilde: A. Foto taget af MSc. Marielsa Gil B. Roto2esdios, fra Wikimedia Commons
Som det kan ses, er den eneste kilde til kulstof i mediet citrat, og af nitrogen er ammoniumphosphat, idet proteiner og kulhydrater udelades som en kilde til disse elementer, de er ofte til stede i andre medier.
Derfor kan bakterierne, der er inokuleret i dette medium, kun reproducere sig, hvis den er i stand til at optage kulstof fra citrat. Testen var positiv, hvis der var turbiditet i mediet, men det havde den ulempe, at ikke-specifik turbiditet kunne forekomme.
Dette problem blev løst af Simmons ved at tilsætte bromothymolblå og agar til Kosers oprindelige formel. Selvom princippet er det samme, fortolkes det forskelligt.
Basis
Nogle bakterier har evnen til at overleve i fravær af gæring eller mælkesyreproduktion og har behov for at få energi gennem brug af andre underlag. I denne test er den eneste tilbudte kulstofkilde citrat.
Bakterier, der er i stand til at overleve under disse betingelser, metaboliserer citrat hurtigt i et alternativ til den traditionelle rute ved hjælp af tricarboxylsyrecyklus eller citratfermenteringscyklus.
Katabolismen af citrat af bakterier involverer en enzymatisk mekanisme uden indgreb af coenzym A. Dette enzym er kendt under navnet citricase (citratoxaloacetat-lyase) eller citrat desmolase. Reaktionen kræver tilstedeværelse af en divalent kation, der i dette tilfælde leveres af magnesium.
Reaktionen genererer oxaloacetat og pyruvat, som derefter giver anledning til organiske syrer midt i en alkalisk pH dannet ved anvendelse af nitrogenkilden. Disse organiske syrer bruges som en kulstofkilde, der genererer carbonater og bicarbonater, hvilket yderligere forkalkler miljøet.
Såningstilstand
Simmons citratmedium skal let inokuleres i fiskestare ved hjælp af en lige sløjfe eller nål og inkuberes i 24 timer ved 35-37 ° C. Efter tiden observeres resultaterne.
Såning foregår kun på overfladen af agaren. Punkter ikke.
Tolkning
Hvis mediet forbliver den oprindelige farve (grønt), og der ikke er nogen synlig vækst, er testen negativ, men hvis mediet bliver blåt, indikerer det tilstedeværelsen af alkaliske produkter, som detekteres af pH-indikatoren. I dette tilfælde er testen positiv.
Citrat (+) og (-). Kilde: MSc. Marielsa gil
Dette sker, fordi hvis bakterien bruger kulstoffet fra citratet, er det også i stand til at optage nitrogenet fra det ammoniumfosfat, som den frigiver ammoniak, og alkaliserer mediet.
På den anden side, hvis vækst af bakterier observeres i mediet, men der ikke er nogen farveændring, skal testen også betragtes som positiv, da hvis der er vækst, betyder det, at bakterierne var i stand til at bruge citrat som en kulstofkilde, selvom der ikke er nogen ændring i pH i øjeblikket (undertiden kan det tage tid).
Hvis der er nogen tvivl om fortolkningen af den endelige farve, kan den sammenlignes med et ikke-inokuleret citratrør.
Forberedelse
Vej 24,2 g af det dehydrerede medium i en liter vand. Bland, og lad det hvile i cirka 5 minutter. Afslut med at opløse mediet ved at opvarme i 1 eller to minutter, og ryst ofte.
Hæld 4 ml i reagensglas og autoklaver ved 121 ° C i 15 minutter. Når du forlader autoklaven, hældes ved hjælp af en støtte på en sådan måde, at agaren stivner i form af et fløjtsnæb med lille blok eller bund og mere skråt.
Den endelige pH for citratmediet er 6,9 (grøn farve). Dette medium er meget følsomt over for ændringer i pH.
Ved pH 6 eller derunder bliver mediet gult. Denne farve observeres ikke i bakterietesten.
Og ved pH 7,6 eller derover bliver mediet dybt preussisk blå.
Brug
Simmons Citrate Agar bruges til identifikation af visse mikroorganismer, især baciller, der tilhører Enterobacteriaceae-familien og andre ikke-glukosegærende baciller.
Kilde: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
Endelige tanker
Simmons citratmedium er en meget delikat test, da der kan opnås falske positiver, hvis der foretages visse fejl.
Den omhu, der skal udvises, er følgende:
inokulum
En meget tyk eller belastet bakterieinokulum bør ikke laves, da det kan forårsage, at en coppery gul farve udvikler sig på såstedet uden at påvirke resten af mediet, men det kan føre til at tro, at der er vækst. Det betyder ikke, at testen er positiv.
Ligeledes kan en tyk inokulum frembringe en falsk positiv, fordi de organiske forbindelser, der er dannet inden i cellevæggene i døende bakterier, kan frigive nok kulstof og nitrogen til at dreje pH-indikatoren.
Derfor er det ideelle at så ved hjælp af nålen i stedet for platinhåndtaget for at undgå at tage overskydende materiale.
sået
På den anden side, når batteriet til biokemiske test til identifikation af den pågældende mikroorganisme frøplanteres, er det vigtigt, at citratforsøget er den første, der inokuleres, for at undgå overførsel af proteiner eller kulhydrater fra et andet medium.
Under denne omstændighed er det muligt at opnå en falsk positiv, fordi ethvert af disse stoffer, der indføres ved en fejltagelse, metaboliseres og vil medføre en ændring i pH.
En anden måde at undgå overførsel af stoffer er at brænde sløjfen godt og tage en ny inokulum mellem en test og en anden.
Man skal også være forsigtig, når man rører ved kolonien for at udføre inokulummet, da det bør undgås at trække en del af agaren fra kulturen, hvorfra bakterierne kommer, på grund af ovenstående forklaret.
I denne forstand anbefaler Matsen, Sherris og Branson at fortynde inokulatet i fysiologisk opløsning inden inokulering af citratforsøget for at undgå overførsel af andre kulstofkilder.
Farveintensitet
Det skal tages i betragtning, at intensiteten af den farve, der produceres, når testen er positiv, kan variere afhængigt af kommercielt hus.
Derudover er der mikroorganismer, der tester positive efter 24 timer, men der er andre stammer, der kræver 48 timer eller mere for at producere en ændring i pH.
Referencer
- Mac Faddin J. (2003). Biokemiske test til identifikation af bakterier af klinisk betydning. 3. udg. Redaktionel Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
- BD Laboratories. BBL Simmons Citrate Agar Slants. 2015. Tilgængelig på: bd.com
- Britannia Laboratories. Simmons Citrate Agar. 2015. Tilgængelig på: britanialab.com
- Valtek Diagnostic Laboratories. Simmons Citrate Agar. 2016. Tilgængelig på: andinamedica.com.