STANDARD AGARPERLE: BEGRUNDELSE, KLARGØRING OG ANVENDELSE - BIOLOGI - 2025

Den standard count agar er et fast ikke-selektivt dyrkningsmedium, designet til kvantificering af den aerobe mikrobielle belastning til stede i prøver af drikkevand, spildevand, mælkedrikke, blandt andre fødevarer. Dette medium er også kendt som PCA-agar, for dets forkortelse i engelsk plade tæller Agar. Det blev skabt i 1953 af Buchbinder, Baris og Goldstein.

Standardantællingsagarmediet er sammensat af gærekstrakt, triptein, glukose, agar og destilleret vand. Denne formulering indeholder basale ernæringselementer, der tillader udvikling af den nuværende aerobe mikrobielle belastning, ikke krævende.

Decimale fortyndinger til tælling af CFU'er i standard agar-tællinger. Kilde: Quentin Geissmann

Da mediet ikke indeholder hæmmere, kan bakterier vokse uden nogen begrænsninger, hvilket gør det ideelt til generel kolonitælling. Plakkkvantificeringsteknikken vil imidlertid ikke detektere alle tilstedeværende bakterier, men kun dem, der er i stand til at vokse under de miljøbetingelser, som den podede standard tæller agar udsættes for.

I denne forstand søger pladekvantificeringsteknikken generelt at bestemme mængden af ​​bakterier af den aerobe mesofile type, dvs. dem, der vokser ved temperaturer mellem 25 og 40 ° C, med en optimal væksttemperatur på 37 ° C..

Denne bakteriegruppe er meget vigtig, fordi de fleste af de patogene bakterier for mennesker findes der.

Det skal bemærkes, at det undertiden kan være interessant at kvantificere mængden af ​​psykrofile bakterier, der findes i fødevarer. Disse bakterier er dem, der vokser ved lave temperaturer (<20 ° C) og er ansvarlige for at få fødevarer til at nedbrydes hurtigere, selv når de køles.

Ligeledes kan termofile bakterier, der udvikler sig i et område mellem 50 ° C og 80 ° C eller mere, være vigtige i bestemte typer fødevarer, såsom konserverede fødevarer.

Mikrobiel kvantificering udtrykkes i kolonidannende enheder (CFU) pr. Gram eller ml prøve.

Basis

Standardtællingsmediet er designet til at muliggøre en vellykket vækst af ikke-hurtige aerobe bakterier, da gærekstrakt, triptein og glucose tilvejebringer de nødvendige næringsstoffer til god mikrobiel vækst.

På den anden side har mediet en lys farve og et gennemsigtigt udseende, hvorfor det er ideelt til visualisering af kolonier, der er udviklet ved den dybfrødningsmetode (pladeslynning).

Kolonitælling ved hjælp af Drigalski-slikkeplademetoden er også mulig.

Når mikrobiel belastning er høj, skal decimalfortyndinger af undersøgelsesprøven foretages for at kunne tælle CFU'erne.

Det skal bemærkes, at dette medium anbefales af American Public Health Association (APHA) til optælling af aerobe mesofiler.

Forberedelse

Vej 23,5 g af det dehydratiserede medium og opløst i en liter destilleret vand. For at opløses fuldstændigt, skal blandingen opvarmes ved ofte at omrøre, indtil den koger. De efterfølgende trin afhænger af podningsteknikken, der skal anvendes.

Til hældepladeteknikken

Fordel ved at dosere 12 til 15 ml i reagensglas. Derefter steriliseres i en autoklav ved 121 ° C i 15 minutter. Lad størkne lodret i form af en blok. Opbevares i køleskab indtil brug.

Smelt stikket, når du skal bruge det. Når den er smeltet, opbevares den i et vandbad ved 44-47 ° C, mens prøverne er forberedt.

Til såning på overfladen

Steriliser mediet i en autoklav ved 121 ° C og fordel derefter 20 ml i sterile petriskåle. Lad størkne, vend om og opbevar i køleskabet, indtil brug.

Temper plader før brug. PH i mediet bør være 7,0 ± 0,2.

Brug

Standard Count Agar bruges i den aerobe mesofile tællingsteknik under mikrobiologisk analyse af vand og mad. Antallet af aerobe mesofiler er nødvendigt, da det bestemmer hygiejnekvaliteten af ​​prøven, der undersøges.

Anvendelsen af ​​denne teknik (ved hjælp af dette medium) tillader den makroskopiske visualisering af isolerede kolonier til deres kvantificering.

Pladehældningsteknik (dybdesåning)

-Behandle

Teknikken består af følgende:

1) Homogeniser prøven for at omfordele bakterierne til stede.

2) En initial suspension fremstilles i en steril flaske eller pose, idet forholdet mellem 10 g eller 10 ml prøve i 90 ml fortyndingsmiddel (^10-1) respekteres.

3) Fra den oprindelige suspension foretages de relevante decimalfortyndinger afhængigt af prøvetypen. Eks: (10- ^-2, ^10-3, ^10-4). Fortynding foretages med peptonvand eller phosphatbuffer.

For at gøre dette, tag 1 ml af den oprindelige suspension og anbring den i 9 ml fortyndingsmiddel, fortsæt fortyndingerne om nødvendigt, tag nu 1 ml af ^10-2 fortyndingen og så videre.

4) Tag 1 ml af hver fortynding og anbring i tomme sterile petriskåle.

5) Til hver plade sættes 12 til 15 ml standard count agar, der tidligere var smeltet og bundfældede ved 44 - 47 ° C.

6) Drej forsigtigt pladerne for at fordele prøven langs agaren jævnt og lad den stivne.

7) Inverter pladerne og inkuber ved 37 ° C ved aerobiose i 24 til 48 timer.

8) Ved afslutningen af ​​tiden undersøges pladerne, og kolonierne tælles i den fortynding, der tillader det. De plader, der har mellem 30 til 300 CFU, er valgt til optællingen.

Tælling kan udføres manuelt, eller du kan bruge kolonitællerudstyret.

De tilladte værdier pr. Ml prøve kan variere fra et land til et andet afhængigt af de regler, de reguleres for.

- Beregning af UFC

Den generelle beregning udføres ved hjælp af følgende formel:

Formel til den generelle beregning af kvantificering af CFU'er. Kilde: National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). Mikrobiologisk analyse af fødevarer, officiel analysemetodik, indikatormikroorganismer. 2014 bind 3. Tilgængelig på: anmat.gov.ar

Udtrykk resultaterne i 1 eller 2 cifre, multipliceres med den relevante base 10. Eksempel: Hvis resultatet er 16.545, afrundes det baseret på det tredje ciffer til 17.000, og det udtrykkes som følger: 1,7 x ¹⁰⁴. Hvis resultatet nu var 16.436, skal du runde det til 16.000 og udtrykke 1.6 x 10 ⁴.

Overfladefrødningsteknik

-Behandle

-Iokulært med 0,1 ml af den direkte prøve, hvis den er flydende, initial suspension ^10-1 eller af de fortløbende fortyndinger 10 ^-2, 10 ^-3 osv., I midten af ​​en standard tæller-agarplade.

- Fordel prøven jævnt med en Drigalski-spatel eller en L-formet glasstang, lad den hvile i 10 minutter.

-Vend pladerne og inkuber aerobt ved 37 ° C i 24 til 48 timer.

- Fortsæt med at tælle kolonierne, vælg de plader, der er i intervallet mellem 20 - 250 CFU.

- Beregning af UFC

Ved beregningen anvendes fortyndingsfaktoren, som er den inverse. Afrundes tallet til 2 betydende cifre (afrunding ifølge den tredje ciffer) og udtrykt i kraft af base 10. Hvis f.eks 224 CFU tælles i prøven uden fortynding (10 ^-1), 22 x 10 ¹ CFU rapporteres, men hvis tallet var 225, 23 x 10 ¹ er CFU rapporteret.

Hvis 199 CFU nu tælles i fortynding ^10-3, rapporteres 20 x 10 ⁴ CFU, men hvis 153 CFU tælles i den samme fortynding, rapporteres 15 x ¹⁰⁴ CFU.

QA

Standardtællingskulturmediet kan evalueres under anvendelse af kendte certificerede stammer, såsom: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 ATCC 12228, Shigella flex.

Hvis kulturmediet er under optimale betingelser, forventes tilfredsstillende vækst i alle tilfælde bortset fra L. fermentum, der kan have et regelmæssigt udbytte.

For at evaluere dyrkningsmediets sterilitet skal en eller to plader af hver forberedt batch (uden inokulation) inkuberes ved 37 ° C i aerobiose i 24 timer. Efter dette tidsrum skal der ikke observeres nogen vækst eller farveændring i mediet.

Begrænsninger

-Smelt ikke agaren mere end én gang.

-Det forberedte medium kan vare op til 3 måneder, så længe det opbevares i køleskab og beskyttet mod lys.

-Dette medium er ikke egnet til krævende eller anaerobe mikroorganismer.

Referencer

1. National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). Mikrobiologisk analyse af fødevarer, officiel analysemetodik, indikatormikroorganismer. 2014 bind 3. Tilgængelig på: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA tæller tæller Agar. 2009. Tilgængelig på:
3. Conda Pronadisa Laboratories. Standard Method Agar (PCA) i henhold til APHA og ISO 4833. Tilgængelig på: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Agar pladetælling. 2015. Tilgængelig på: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B og Velázquez O. 2009. Teknikker til mikrobiologisk analyse af fødevarer. 2. udgave Fakultet for kemi, UNAM. Mexico. Fås på: depa.fquim.unam