Den EMB agar er et selektivt og differentielt medium anvendt til fast kultur isolering af gramnegative baciller, især Enterobacteriaceae og andre Gram-negative bakterier undemanding. Det er også kendt under forkortelsen EAM, der står for eosin-methylenblå.
Dette medium blev oprettet af Holt-Harris og Teague i 1916. Det indeholder pepton, lactose, saccharose, dipotassiumphosphat, agar, eosin, methylenblåt og vand. Det ligner meget MacConkey Agar, især når du bruger Levines modificerede EMB Agar, som ikke indeholder saccharose.
Metallisk glans af Escherichia coli på EMB-agar Kilde: Carmen Moreno González, fra Wikimedia Commons
Faktisk beslutter hvert laboratorium, om de vil arbejde med det ene eller det andet, da de udfører den samme funktion, skønt biokemisk er de forskellige.
Det har endda den samme ulempe som klassisk MacConkey-agar med hensyn til opvarmning af slægten Proteus. For at undgå dette fænomen kan agarkoncentrationen derfor øges med op til 5%.
Basis
Selektiv
EMB-agar er subtil selektiv, fordi den indeholder anilinfarvestoffer (eosin og methylenblå), der fungerer som hæmmere og forhindrer vækst af de fleste Gram-positive bakterier og nogle hurtige Gram-negative stænger.
Imidlertid har denne agar den ulempe, at nogle Gram-positive bakterier kan modstå tilstedeværelsen af de inhiberende stoffer og vokse som små farveløse punkteringskolonier, såsom Enterococcus faecalis og nogle Staphylococcus.
Visse gær kan også vokse, såsom Candida albicans-komplekset, som vil give meget små lyserøde kolonier. Chlamydosporer kan endda udvikle sig fra denne gær, hvis prøven er dybfrøet.
Differential
På den anden side er EMB-agar også et differentielt medium, da disse farvestoffer tilsammen (eosin og methylenblå) har egenskaben til at danne et bundfald ved sur pH, hvorfor de tjener som indikatorer for dets produktion.
Således producerer svagt lactose- eller saccharosegærende bakterier lilla kolonier inden for 24 til 48 timer. For eksempel slægterne Klebsiella, Enterobacter og Serratia.
De bakterier, der stærkt fermenterer lactose, såsom Escherichia coli eller sucrose, såsom Yersinia enterocolitica eller Proteus penneri, danner et grønligt-sort bundfald, hvilket giver et karakteristisk metallisk glansudseende i disse arter.
Det skal bemærkes, at hvis EMB-levine-medium (uden saccharose) anvendes, vil Yersinia enterocolitica og Proteus penneri producere klare kolonier.
Bakterier, der ikke fermenterer lactose eller saccharose, næres af tilstedeværelsen af peptoner, der tilvejebringer de aminosyrer og nitrogen, der er nødvendige til bakterievækst, og producerer klare kolonier. F.eks. Slægterne Salmonella og Shigella.
Ligeledes er det vigtigt at bemærke, at Acinetobacter-slægten kan præsentere lavendelblå kolonier, selvom det ikke er en laktosegæring eller sucrose, men har egenskaben af at fikse methylenblå på dens cellevæg. Dette kan også ske med andre oxidative bakterier.
Forberedelse
Det originale dehydratiserede medium er lys beige i farve.
For at fremstille dette dyrkningsmedium skal 36 gram af det dehydrerede medium vejes og suspenderes i en kolbe, der indeholder en liter destilleret vand.
Efter at blandingen har hvilt i 5 minutter, tag kolben til en varmekilde, bland den kraftigt og konstant, indtil den koger og opløses helt.
Efterfølgende skal det allerede opløste kulturmedium steriliseres under anvendelse af autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter.
Ved afslutningen af tiden fjernes den fra autoklaven og lodes stå kort. Derefter serveres stadig varm (45-50 ° C) 15-20 ml agar i hver steril petriskål. Mediet skal være lakmusblåt.
Efter servering efterlades pladerne lidt afdækket, indtil agaren afkøles lidt. De dækkes derefter og får lov at størkne fuldstændigt. Derefter arrangeres de i omvendte pladeholdere og opbevares i køleskab (8 ° C) indtil brug.
Denne procedure udføres fortrinsvis i en laminar flowhætte eller foran en Bunsen-brænder for at undgå forurening.
Det er vigtigt at huske, at hvert kommercielt hus vil angive den mængde, der skal vejes for at forberede kulturmediet.
Mediets endelige pH skal være 7,2 ± 0,2
Applikationer
Dette medium bruges til at så urin og fæces eller en hvilken som helst type klinisk prøve, især hvis der er mistanke om ikke-fastidiske Gram-negative baciller, såsom bacillerne, der tilhører Enterobacteriaceae-familien, som vokser meget godt på dette medium.
Enteropatogene bakterier i Shigella- og Salmonella-slægterne skelnes ved deres farveløse eller let ravfarvede kolonier.
Andre ikke-laktose-gærende baciller, såsom Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter, vokser også.
Ligeledes er dette medium meget nyttigt i den mikrobiologiske analyse af fødevarer og vand, da det er ideelt til den komplette bekræftelsesfase til bestemmelse af coliforme former, dvs. af den mest sandsynlige antal teknik (MPN).
QA
For at verificere, at det frisk fremstillede kulturmedium fungerer godt, kan kontrolstammer plantes for at observere koloniernes karakteristika og kontrollere, at de giver som forventet.
Til dette kan ATCC-stammer eller velidentificerede stammer af E. coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa og nogle Gram-positive bakterier, såsom S. aureus, anvendes.
E. coli forventes at generere veludviklede blå-sorte kolonier med en grøn metallisk glans. Mens Enterobacter aerogenes og Klebsiella sp skulle give veludviklede blå-sorte slimkolonier.
På den anden side skal Salmonella typhimurium og Shigella flexneri udvikle store kolonier, farveløse eller med en let ravfarve.
Til sidst vokser slægten Pseudomonas aeruginosa som farveløse kolonier af uregelmæssig størrelse, hvorimod Gram-positive bakterier bør inhiberes totalt eller vokse tyndt med meget små kolonier.
Endelige tanker
Nogle gange får sterilisering reduceret methylenblå, der viser en medium orange farve. For at methylenblå skal oxidere og genvinde den lilla farve, skal den blandes forsigtigt, indtil farven er genvundet.
Efter sterilisering kan farvestoffet også udfælde, så det bør blandes godt, inden Petri-skålene serveres.
Referencer
- Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B og Velázquez O. 2009. Teknikker til mikrobiologisk analyse af fødevarer. 2. udgave Fakultet for kemi, UNAM. Mexico.
- Carranza C, León R, Falcón N, Neumann A, Kromm C. Karakterisering og distribution af potentielt patogene Escherichia coli-stammer isoleret fra slagtekyllinger fra fjerkræbedrifter i Peru. Rev. investiga. dyrlæge. Peru 2012 23 (2): 209-219. Fås på: scielo.org.
- Laboratorios Conda SA Eosin og Methylene Blue Agar. 2010. Tilgængelig på: condalab.com
- Britannia Laboratories. Levine EMB (With Eosin and Methylene Blue) 2011. Tilgængelig på: britanialab.com
- BD Laboratories. BD EMB Agar (Eosin Methylene Blue Agar), modificeret. 2013. Tilgængelig på: bd.com
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. (5. udgave). Argentina, Redaktion Panamericana SA
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Argentina. Redaktionel Panamericana SA