SABOURAUD AGAR: FUNDAMENT, KLARGØRING OG ANVENDELSE - BIOLOGI - 2025

Den agar Sabouraud, også kendt som Sabouraud dextrose agar, er et fast medium, især beriget til isolering og udvikling af svampe, såsom gær, skimmelsvampe og dermatophyter.

Derfor kan dette medium ikke mangle i et mikrobiologisk laboratorium for at undersøge tilstedeværelsen af ​​patogene eller opportunistiske svampe, hverken fra kliniske eller ikke-kliniske prøver. Ligeledes er det også ideelt til vækst af filamentøse bakterier såsom Streptomyces og Nocardias. Dets anvendelse er meget bred, da den kan bruges inden for mennesker, dyr, planter og industriel mykologi.

A. Ubegrundet Sabouraud-agar. B. Sabouraud agar frøet med en gær. Kilde: Fotos taget af forfatteren MSc. Marielsa gil

Dette medium blev skabt i 1896 af den fremtrædende hudlæge Raimond Sabouraud, der blev en verdenskendt specialist i forstyrrelser i hovedbunden, hovedsageligt forårsaget af dermatofytter.

Dens oprettelse var så vigtig, at det har været brugt lige siden og forbliver i dag, skønt med nogle ændringer.

Selv om det er specielt til svampe, kan bakterier vokse i dette medium, derfor er det nødvendigt at inkludere antibiotika i prøver med deres blanding for at hæmme væksten af ​​bakteriefloraen, der kan være til stede, for prøver med blandet flora.

Valget af antibiotikum skal foretages omhyggeligt og under hensyntagen til den type svamp, der skal udvindes, da nogle hæmmes i nærværelse af visse stoffer.

Basis

Sabouraud dextrose-agar er et medium, der i sin oprindelige formulering er svagt selektiv på grund af dets sure pH på 5,6 ± 0,2, men bakterier kan dog stadig udvikle sig, hovedsageligt i langvarige inkubationer.

Mediet indeholder kaseinpepton og pancreas fordøjelse af dyrevæv, som tilvejebringer kilden til kulstof og nitrogen til vækst af mikroorganismer.

Det indeholder også en høj koncentration af glukose, der fungerer som en energikilde, der fremmer væksten af ​​svampe frem for bakterier. Alt dette blandet med agar-agar, en komponent, der giver den den rette konsistens.

På den anden side kan Sabouraud dextrose agar være selektiv, hvis der tilsættes antibiotika.

Med antibiotika er det især nyttigt i prøver af sår, åbne mavesår eller enhver prøve, hvor der er mistanke om stor bakteriekontaminering.

Mest anvendte kombinationer af Sabouraud dextrose-agar med antibiotika

-Saburaud-agar med chloramphenicol: ideel til genvinding af gær og filamentøs svamp.

- Sabouraud-agar med gentamicin og chloramphenicol: næsten alle filamentøse svampe og gær vokser i dette medium, og det hæmmer et stort antal bakterier, inklusive Enterobacteria, Pseudomonas og Staphylococcus.

- Sabouraud-agar med cycloheximid: det er især nyttigt til prøver fra huden eller luftvejene, så længe mistanken er dimorf.

Cycloheximid skal anvendes med forsigtighed; Selvom det bruges til at hæmme væksten af ​​ikke-patogene svampe og gærer, der kan være til stede som forurenende stoffer i en prøve, hæmmer det også væksten af ​​nogle svampe, såsom Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp og andre opportunistiske svampe.

- Sabouraud-agar med chloramphenicol plus cycloheximid: det bruges hovedsageligt til at isolere dermatofytter og dimorfe svampe. Det har den ulempe, at det hæmmer nogle arter af opportunistiske svampe, såsom Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes eller C. neoformans.

- Sabouraud agar med chloramphenicol, streptomycin, penicillin G og cycloheximid: det er ideelt til prøver, der er ekstremt forurenet med bakterier og saprophytiske svampe, men har den ulempe, at det hæmmer væksten af ​​Actinomyces og Nocardias, ud over de ovennævnte opportunistiske svampe.

Forberedelse

Hvis du har ingredienserne separat, kan de tilberedes som følger:

Sabouraud dextrose agar

At veje:

- 40 g dextrose

- 10 g pepton

- 15 g agar-agar

- Mål 1000 ml destilleret vand

Alle ingredienser blandes, pH indstilles til 5,6. De opløste stoffer opløses ved kogning, 20 ml af mediet fordeles i rør på 25 x 150 mm, uden kant og fortrinsvis med en bomuldshætte.

Rør med bomuldshætte. Kilde: Foto taget af forfatteren MSc. Marielsa gil

Andre rørstørrelser kan også bruges, afhængigt af tilgængelighed.

De autoklaveres i 10 minutter ved en atmosfære af tryk (121 ° C). Autoklaveringstiden bør ikke overskrides. Når man forlader autoklaven, hældes rørene ved hjælp af en støtte, indtil de størkner i et fløjtebeb.

En anden måde er at opløse ingredienserne ved at opvarme, indtil det koger op. Autoklaver i 10 minutter i det samme hætteglas og fordel derefter 20 ml i petriskåle.

Hvis du har et Sabouraud dextrose agar-medium, der allerede indeholder alle ingredienserne, skal du fortsætte med at veje den mængde, der er angivet af det kommercielle firma, for en liter vand. Resten af ​​trinnene er de samme som beskrevet ovenfor.

Sabouraud dextrose agar (Emmons modifikation)

At veje:

- 20 g dextrose

- 10 g pepton

- 17 g agar-agar

- Mål 1000 ml destilleret vand

Alle ingredienser blandes, pH indstilles til 6,9. Fortsæt på samme måde som den forrige sag.

Der er kommercielle huse, der tilbyder mediet med alle ingredienserne. I dette tilfælde skal du veje og forberede som beskrevet på indsatsen.

Sabouraud dextrose agar (Emmons modifikation) med chloramphenicol

Chloramphenicol-stamopløsning

- Vej 500 mg chloramphenicolbase

- Mål 100 ml 95% ethanol

- Blande

Sabouraud dextrose-agarmedium (Emmons) fremstilles som tidligere beskrevet, og der tilsættes yderligere 10 ml chloramphenicol stamopløsning før autoklavering for hver liter medium.

Sabouraud emmoner dextrose agar med cycloheximid

Cycloheximide stamopløsning

- Vej 5 g cycloheximid

- Mål 100 ml acetone

- Blande

Sabouraud dextrose-agarmedium (Emmons) fremstilles som allerede beskrevet, og der tilsættes yderligere 10 ml cycloheximid-stamopløsning for hver liter medium før autoklavering.

Sabouraud dextrose agar (Emmons) med chloramphenicol og cycloheximid

Sabouraud dextrose agarmedium (Emmons) fremstilles som tidligere beskrevet, og der tilsættes yderligere 10 ml chloramphenicol stamopløsning og 10 ml cycloheximid stamopløsning før autoklavering for hver liter medium.

Andre antibiotika, der kan tilføjes

20.000 til 60.000 enheder penicillin per liter medium.

30 mg streptomycin pr. Liter medium.

Begge skal inkorporeres, når mediet er autoklaveret, let afkølet (50-55 ° C).

0,04 g neomycin pr. Liter medium.

0,04 g gentamicin pr. Liter medium.

Særlige overvejelser

Af hensyn til sikkerheden foretrækkes det at så Sabouraud dextrose-agar i kileformede rør (skråtstillet i fløjte næb) snarere end i Petri-skåle for at undgå spredning og indånding af sporer.

Det er vigtigt, at Sabouraud-agarrør er dækket med bomuld og ikke med en skruehætte, da det har vist sig, at semi-anaerobe tilstande hæmmer sporedannelse i nogle stammer, for eksempel Coccidioides immitis. De fleste svampe er også aerobe.

I tilfælde af brug af skruehætte må du ikke lukke hermetisk.

QA

Det forberedte medie skal gennemgå kvalitetskontrol for at verificere, at det fungerer korrekt. Til dette sås visse kontrolstammer.

Til Sabouraud dextrose-agar med chloramphenicol kan der anvendes ATCC-stammer af Candida albicans, som skal have en fremragende vækst. En anden plade inokuleres med Escherichia coli-stammer, som skal inhiberes fuldstændigt.

En uinokuleret plade inkuberes også, hvori ingen mikroorganismer bør vokse.

Til Sabouraud dextrose-agar med chloramphenicol og cycloheximid kan stammer af Trichophyton mentagrophytes anvendes, og de bør udvikle sig godt. En anden plade inokuleres med en stamme af Aspergillus flavus, hvor der må være ringe eller ingen vækst. Derudover inkuberes en uinokuleret plade for at demonstrere dens sterilitet.

Til Sabouraud bruges dextrose-agar med cycloheximid, stammer af Candida albicans, Trichophyton rubrum eller Microsporum canis, som skal vise god vækst.

Ligeledes er en stamme af Aspergillus flavus inkluderet, der viser ringe eller ingen vækst. Endelig inkuberes en ikke-inokuleret plade for at kontrollere sterilitet.

Applikationer

Primær kultur

Klassisk Sabouraud dextrose-agar indeholder 4 gram dextrose og er fremragende som et primært isoleringsmedium, da det viser den karakteristiske morfologi for hver svamp.

Det er også fremragende til at demonstrere pigmentproduktion. Det er dog ikke det bedste middel til at observere sporulation.

Det anbefales heller ikke til dyrkning af Blastomyces dermatitidis, som hæmmes af den høje koncentration af glukose, der er til stede.

På den anden side skal der med hensyn til dyrkning tages hensyn til visse overvejelser.

Nogle svampe vokser bedst ved stuetemperatur, såsom forme, andre vokser med succes ved 37 ° C, såsom nogle gærer, og andre kan vokse ved begge temperaturer (dimorf svampe).

Af denne grund er det undertiden nødvendigt at bruge adskillige Sabouraud-agarplader til den samme prøve, da dobbelt såning ofte udføres for at inkubere en plade ved stuetemperatur og en anden ved 37 ° C.

For eksempel sås Sporothrix schenckii i to plader; den ene inkuberes ved stuetemperatur for at opnå formfasen, og den anden inkuberes ved 37 ° C for at opnå gærfasen, men i sidstnævnte er det nødvendigt at tilsætte 5% blod til mediet.

I andre tilfælde, såsom mycetomaprøver, podes to Sabouraud-agarplader, den ene med chloramphenicol og den anden med cycloheximid. Den første tillader vækst af mycotoma-forårsagende stoffer af svampeoprindelse (Eumycetoma) og det andet forårsagende middel til mycetom af bakteriel oprindelse, såsom actinomycetomer.

sporulation

Emmons 'modificerede Sabouraud dextrose-agar indeholder 2 gram dextrose og bruges ikke kun til isolering, men også til sporulation og konservering af svampe.

I dette medium kan stammer af Blastomyces dermatitidis udvindes.

Bevarelse

For at bevare svampekulturer kan de opbevares i køleskab (2-8 ° C). Konserveringstiden kan variere mellem 2 til 8 uger. Efter denne tid skal de underkultureres for at gentage processen.

Nogle svampe holder sig bedst ved stuetemperatur, såsom Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum og Microsporum audounii.

Vedligeholdelse af stammen kan forlænges for at undgå pleomorfisme, hvis dextrosen fjernes fuldstændigt fra agaren, og hvis mængden af ​​agar i mediet reduceres for at undgå tørhed.

mikrokulturer

Til identifikation af nogle filamentøse svampe er det nødvendigt at udføre mikrokulturer ved anvendelse af Sabouraud-agar eller andre specielle midler til at observere strukturerne i seksuel og aseksuel reproduktion.

I menneskelig mykologi

Det bruges hovedsageligt til diagnose af svampesygdomme, især dem, der påvirker huden og dens vedhæftninger (hår og negle).

Prøverne kan være sekretioner, ekssudater, hud, hår, negle, sputum, CSF eller urin. Almindeligvis isolerede patogener er dermatophytter, svampe, der forårsager subkutane og systemiske mycoser.

Dyremykologi

Dyr påvirkes ofte af svampeinfektioner, derfor er Sabouraud-agar lige så nyttig i dyre-mykologi som i mennesker.

For eksempel kan dermatophytter ofte påvirke dyr. Sådan er tilfældet med Microsporum canis var distortum, som ofte inficerer hunde, katte, heste, grise og aber. Ligeledes inficerer Microsporum gypseum hunde, katte og husdyr.

Fugle som kyllinger, haner og kyllinger påvirkes af Microsporum gallinae.

Andre svampe, såsom Zymonema farciminosum, er også årsagen til sygdom hos dyr, hovedsageligt hos heste, muldyr og æsler, hvilket producerer betydelig betændelse i lymfekarrene.

Sporothrix schenkii og Histoplasma capsulatum påvirker husdyr og mennesker.

Miljømykologi

Mange patogene eller opportunistiske svampe kan koncentrere sig på et givet tidspunkt i et givet miljø, især i operationsstuer og Intensive Care Units (ICUs) i klinikker og hospitaler. Derfor er det nødvendigt at udføre en kontrol med dem.

Andre sårbare rum er biblioteker og gamle bygninger, der kan påvirkes af koncentrationen af ​​miljøsvampe.

I miljøundersøgelser anvendes Sabouraud dextrose agar til isolering af svampe.

Industriel mykologi

Sabouraud dextrose-agar kan ikke være fraværende til undersøgelse af kontaminerende svampe til fremstilling af blandt andet kosmetik, mad, drikkevarer, læder, tekstiler.

Plante mykologi

Planter lider også af sygdomme forårsaget af svampe, der påvirker forskellige dele af planten, som endda kan afslutte høsten, hvilket medfører store tab i landbruget.

Referencer

1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikrobiologisk diagnose af mycoser og svampesensitivitetsundersøgelser. Anbefalinger fra det spanske selskab for infektionssygdomme og klinisk mikrobiologi. Fås på: coesant-seimc.org
2. ValteK Laboratory. (2009). Sabouraud dextrose agar med cycloheximid. Fås på: andinamedica.com.
3. Navarro O. (2013). Veterinær mykologi. National Agrarian University. Nicaragua.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Argentina. Redaktionel Panamericana SA
5. Casas-Rincón G. Generel mykologi. 1994. 2. udg. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.