Den TCBS agar er et middel af stærkt selektiv og differentieret fast kultur, der anvendes til isolering og dyrkning af bakterier af slægten Vibrio, især Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus og V. vulnificus som vigtige patogener af denne art.
Forkortelsen TCBS står for Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Denne agar er også kendt som et selektivt medium for Vibrios. Den originale formel blev oprettet af Nakanishi og senere modificeret af Kobayashi.
Kommerciel TCBS medium og TCBS agarplade podet med Vibrio cholerae. Kilde: foto 1: taget af forfatteren MSc. Marielsa Gil / Foto 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, Indien
Det er sammensat af gærekstrakt, kødpepton, triptein, natriumcitrat, natriumthiosulfat, oxgald, saccharose, natriumchlorid, jerncitrat, bromothymolblå, thymolblå og agar.
Denne sammensætning tillader en tilstrækkelig udvikling af Vibrio-arter fra vand, fødevarer og fæces prøver; med undtagelse af Vibrio hollisae, der ikke vokser på dette medium. Endvidere er TCBS-medium i stand til at hæmme væksten af andre ledsagende bakterier, især coliformer.
På grund af de alvorlige mave-tarm-og ekstra-intestinale problemer, der er produceret af nogle arter af Vibrio-slægten, er diagnosen meget vigtig. Mennesker inficeres hovedsageligt ved at spise rå eller underkokt mad fra havet eller forurenede farvande, men også gennem sårinfektion.
På grund af dette skal kliniske laboratorier indbefatte TCBS-agar i afføringskulturundersøgelsen af prøver med flydende afføring, især med udseendet af risvand. Især hvis patienten rapporterer at have været i kontakt med havvand eller have spist skaldyr eller fisk.
Basis
Gærekstrakt, kødpeptoner og triptein er ernæringskilden til dette medium. TCBS-agar er imidlertid et uvurderligt medium for de fleste bakterier.
Dets høje selektivitet gives ved tilsætning af natriumcitrat og oxgald; begge er inhiberende midler, der også tilvejebringer en basisk pH-værdi til mediet, hvilket begrænser væksten af den ledsagende flora og favoriserer væksten af V. cholerae blandt andre arter. Det skal bemærkes, at Vibrio cholerae er meget følsom over for syreindhold.
På sin side balancerer natriumchlorid mediet osmotisk. Eftersom dens koncentration er høj, fungerer den også som et hæmmende middel, hvilket favoriserer væksten af halofile bakterier.
Sucrose er det fermenterbare sukker, der sammen med bromothymolblå og thymolblå pH-indikatorer giver mediet dens differentielle karakter. Af denne grund er det med dette medium muligt at differentiere sucrose-fermenteringsstammer fra ikke-fermenterende stammer.
Kolonier af saccharosegæringsstammer udvikler gul farve og vil gøre mediet fra grønt til gult på grund af syreproduktion. De ikke-fermentorer vokser gennemskinnelige, og mediet forbliver den oprindelige farve (grønt).
Ligeledes indeholder dette medium natriumthiosulfat som en kilde til svovl og jerncitrat som et udviklingsmiddel. Begge viser bakterier, der er i stand til at producere hydrogensulfid (farveløs gas). H 2 S er dannet af thiosulfat og efterfølgende ved omsætning med ferricitrat en synlig sort bundfald.
Endelig er agaren det, der giver mediet den faste konsistens.
Forberedelse
Vej 89 g af det dehydrerede medium og opløst i en liter destilleret vand. Hjælp med opløsningen ved opvarmning og hyppig omrøring. Blandingen kan koges i op til 2 minutter.
Dette medium er ikke autoklaveret. Efter opløsning serveres det direkte på sterile plader. Når de størkner, arrangeres de omvendt på blodplader og opbevares i køleskab (2-8 ° C) indtil brug.
Mediet efter tilberedning skal forblive ved pH 8,6 ± 0,2.
Farven på det dehydrerede medium er lys beige eller grønlig-beige, og farven på mediet er skovgrønt eller blåligt grønt.
Det er vigtigt at lade pladerne opvarme, før prøverne podes.
Brug
Den mest almindelige prøve til Vibrios-isolering er diarréskammel.
Afføringsprøver, hvis de ikke umiddelbart kan podes på det selektive medium, skal transporteres på Cary Blair-mediet.
For at øge kulturens følsomhed kan afføringen ledes gennem peptonvand ved pH 8,4 som et berigelsesmedium i højst 8 timer, hvorfra det subkultureres til TCBS-mediet.
Det skal også tages i betragtning, at nogle stammer af Vibrios kan forårsage septikæmi hos immunsupprimerede patienter, derfor kan de isoleres fra blodkulturer. Ligeledes kan prøver af vand og mad fra havet analyseres, når der er epidemiske udbrud af kolera sygdom.
sået
Undersøgelsens inokulum skal være fremtrædende, såningen udføres ved strippemetoden ved udmattelse. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i aerobiose.
De formodede kolonier af Vibrio cholerae er mellemstore, glatte, uigennemsigtige, med tynde kanter og gule i farve på grund af fermenteringen af saccharose.
Arterne af V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii og nogle V. vulnificus vokser på lignende måde. Andre klinisk vigtige Vibrios-arter såsom V. parahaemolyticus fermenterer ikke saccharose og udvikler sig som olivengrønne kolonier.
TCBS agarplade podet med Vibrio parahaemolyticus. Kilde: isis325 Flickr
På den anden side må det huskes, at nogle stammer af Aeromonas og Plesiomonas, der er oxidase (+), kan vokse i dette medium, hvilket udvikler gule kolonier, der kan forvirre klinikeren. Mens nogle stammer af Pseudomonas også oxidase (+) vokser som grønne kolonier som V. parahaemolyticus.
Begrænsning
Den oxidasetest, der er positiv for Vibrio-slægten, bør aldrig udføres fra kolonier, der er opnået fra TCBS-agar, da det opnåede resultat vil være en falsk negativ. Forbindelser i midten forstyrrer denne test kraftigt. Derfor skal det fremstilles af subkulturer på blodagar.
QA
For at bevise, at mediet er i god stand, tilrådes det at så kendte eller certificerede kontrolstammer og observere, om væksten opfylder de forventede egenskaber.
Til dette kan du bruge stammer af:
-Vibrio cholerae - tilfredsstillende vækst (gule kolonier, gennemskinnelig grænse).
-Vibrio parahaemolyticus --– tilfredsstillende vækst (koloni med grønt centrum og gennemskinnelig grænse).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - tilfredsstillende vækst (gule kolonier med glorier af samme farve omkring kolonien).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - total eller delvis hæmning (små gule eller gennemskinnelige kolonier).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853- - delvis eller total hæmning (blå kolonier).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Helt hæmmet.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Total eller delvis hæmning. (Små kolonier grøn midt gennemsigtig grænse).
Inkubation af uinokuleret medium bør være uændret.
Referencer
- Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories. TCBS-agar. 2009. Tilgængelig på: f-soria.es
- BD-laboratorium. BD. TCBS Agar 2003. Tilgængelig på: bd.com
- Britannia Laboratories. TCBS Medium. 2015. Tilgængelig på: britanialab.com
- Acumedia Laboratories. TCBS Agar. 2016. Tilgængelig på: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12 udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udg. Redaktionel Panamericana SA Argentina.