ETHIDIUMBROMID: STRUKTUR, EGENSKABER, ANVENDELSER, TOKSICITET - KEMI - 2024

Den ethidiumbromid er et fluorescerende aromatisk forbindelse med evnen til, på grund af dens kemiske struktur, der skal indsættes mellem DNA-kæder. Det binder også til stærkt foldede RNA-molekyler. Dette muliggør en interaktion mellem dette salt og de nitrogenholdige baser.

Ethidiumbromid absorberer ultraviolet lys i et bølgelængdeområde fra 210 nm til 285 nm, hvilket udsender en orange fluorescens på 605 nm. Intensiteten af ​​dens fluorescens øges op til 20 gange, når den interagerer med DNA.

DNA-farvning med ethidiumbromid fluorescerende under UV-stråling på agarosegel. Kilde: School of Natural Resources fra Ann Arbor

På grund af dens fluorescensegenskab bruges ethidiumbromid til at visualisere adskilte DNA-fragmenter ved agaroseelektroforese (øverste billede); teknik introduceret uafhængigt af Aaij og Borst (1972) og Sharp (1973).

Ethidiumbromid, når det blev sammenkaldt mellem DNA-kæder, kunne også hindre dets duplikations- og transkriptionsprocesser; og derfor være årsagen til genereringen af ​​mutationer. Der er dog ingen afgørende beviser for at støtte denne antagelse.

Kemisk struktur

Molekylær struktur af ethidiumbromid. Kilde: Calvero.

I det øverste billede har vi molekylstrukturen af ​​ethidiumbromid repræsenteret ved dens strukturelle formel.

Molekylet er næsten helt flad, fordi alle atomerne i dannet af de tre ringe (phenanthridin) og det positivt ladede nitrogenatom systemet har sp ² hybridisering. Men det er ikke det samme med dets substituentgrupper.

Den yderste højre phenylgruppe, aminogrupperne og den ethylgruppe, der er bundet til det ladede nitrogen, er ansvarlig for systemet, der absorberer UV-bølgelængderne, der derefter kendetegner fluorescensen af ​​ethidiumbromid.

Bemærk på den anden side, at deres intermolekylære interaktioner hovedsageligt styres af elektrostatiske attraktioner; og i mindre grad holdes de sammen af ​​Londons spredningskræfter.

Ejendomme

Navn

Ethidiumbromid.

IUPAC-navn: 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromid.

Synonymer: homide bromide og Dromilac.

Molekylformel

C ₂₁ H ₂₀ N ₃ Br

Fysisk fremtoning

Mørkerøde krystaller eller forekommer som et brunt pulver.

Smag

Bitter.

Lugt

Lugtløs fast.

Smeltepunkt

260-262 ° C (nedbrydes).

tændingspunkt

> 100 ºC

Opløselighed

40 g / l ved 25 ° C i vand og 2 mg / ml i ethanol.

Massefylde

0,34 g / cm ³

Damptryk

1,2 · 10 ^-12 mmHg ved 25 ° C (estimeret).

Oktanol / vand-fordelingskoefficient

Log Kow = - 0,38

nedbrydning

Når det opvarmes til nedbrydning, udsender ethidiumbromid en meget giftig røg af brintbromid og nitrogenoxider.

Stabilitet

Stabil og uforenelig med stærke oxidationsmidler.

Brydningsindeks

1,67 (estimeret).

pH

4-7 i en 2% opløsning i vand.

Applikationer

Polymerasekædereaktion (PCR)

Polymerasekædereaktionen, PCR, tillader at opnå mange kopier eksponentielt ud fra et DNA-fragment. Teknikken er baseret på egenskaben af ​​DNA-polymeraseenzymet til at replikere DNA-strenge fra dets fragmenter, der tjener som en skabelon.

Det er en teknik, der har uendelige anvendelser, herunder påvisning af mutationer relateret til arvelige sygdomme; faderskabstest; identifikation af en person, der har begået en forbrydelse osv.

Ethidiumbromid hjælper med at identificere DNA-fragmenter, produkter fra dets enzymatiske nedbrydning, der kan bruges i PCR-teknikken.

Agarose og acrylamidgelelektroforese af DNA

Ethidiumbromidet inkorporeres i gelen inden elektroforese-udførelsen. Forbindelsen er klemt fast mellem DNA-båndene og producerer en fluorescens, når den udsættes for ultraviolet lys, der tjener til at afsløre DNA-fragmenterne, der adskilles ved elektroforese.

Fluorescensmønsteret for elektroforesen fungerer som en orientering omkring DNA-fragmenternes oprindelse. Bindingen af ​​ethidiumbromid til DNA ændrer konformation, ladning, vægt og fleksibilitet af DNA-molekylet, hvilket resulterer i en reduktion i mobiliteten af ​​makromolekylet.

Denne virkning øges, når størrelsen af ​​DNA-fragmentet øges.

Virkning af ethidiumbromid på trypanosomer

Ethidiumbromid begyndte at blive brugt til behandling af trypanosomiasis hos kvæg i 1950'erne under navnet Homidio. Derfra kom navnet homide bromide som et synonym for ethidium bromide.

Den terapeutiske anvendelse af ethidiumbromid er baseret på dets toksicitet over for mitokondrier. Dette manifesteres ved en reduktion i antallet af kopier af mitokondrielt DNA.

Ethidiumbromid binder til DNA-molekylerne i trypanosomkinetoplasten og ændrer dets konformation til DNAz. Denne form for DNA er dødelig, da dens replikation er inhiberet.

Anvendelse i en dyremodel af multippel sklerose

Direkte injektion af ethidiumbromid i cistern magna frembragte en reproducerbar akut myelintab-læsion i hjernestammen hos rotter. Den samme rygmarvsinjektion hos katte producerede en læsion, der kan sammenlignes med den, der blev set hos rotter.

Multipel sklerose er en autoimmun sygdom i nervesystemet, hvor immunsystemet ødelægger myelin, et stof, der dækker neuroner.

Toksicitet

Exposition

Ethidiumbromid betragtes som en giftig forbindelse, da det ved indånding medfører akut irritation af luftvejene. Ved kontakt med huden kan ethidiumbromid også forårsage betændelse og / eller misfarvning.

I mellemtiden forårsager akut eksponering irritation, rødme og smerter i øjnene i øjnene. Derfor anbefales det, at materialet, der bruges med ethidiumbromid, håndteres med MMS-sikkerhedsdatabladet.

Mutagen karakter

Ethidiumbromid betragtes som en yderst mutagen forbindelse, da det, når det interkaleres i DNA, kunne påvirke dets duplikering og transkription og forårsage mutationer; og endda er der påpeget en mulig kræftfremkaldende virkning.

AMES-testen påviste kun induktion af mutationer af ethidiumbromid i bakterier, når der blev anvendt et leverhomogenat i testen.

Dette fik os til at tænke, at det ikke er direkte ansvarligt for forekomsten af ​​mutationer i bakterier, men at disse kunne være konsekvensen af ​​virkningen af ​​en del metabolit dannet i interaktionen af ​​ethidiumbromid med leverhomogenatet.

På den anden side fastslog The Natural Toxicology Program, at ethidiumbromid ikke var mutagent for rotter og mus. På trods af dette reduceres brugen i laboratorierne, der bruger det i deres forskning.

Imidlertid er koncentrationen af ​​ethidiumbromid, der blev anvendt i undersøgelserne, en tusindedel af koncentrationen af ​​dosis givet til kvæg til behandling af trypanosomiasis uden forekomsten af ​​mutationer.

Referencer

1. Doronina Vicki. (2017). Burning Bright: en kort historie med ethidiumbromid-DNA-farvning. Gendannes fra: bitesizebio.com
2. Wikipedia. (2020). Ethidiumbromid. Gendannet fra: en.wikipedia.org
3. ElSevier BV (2020). Ethidiumbromid. ScienceDirect. Gendannes fra: sciencedirect.com
4. Royal Society of Chemistry. (2020). Ethidiumbromid. Gendannes fra: chemspider.com
5. Kemisk bog. (2017). Ethidiumbromid. Gendannes fra: Chemicalbook.com
6. Det polytekniske universitet i Valencia. (2012). Standardprocedure for arbejde med ethidiumbromid. Gendannes fra: sprl.upv.es