IMMUNFLUORESCENS: BEGRUNDELSE, PROTOKOL OG APPLIKATIONER - BIOLOGI - 2025

Den immunfluorescens er en kraftfuld teknik immunofarvning under anvendelse af antistoffer kovalent bundet til fluorescerende molekyler til at identificere specifikke mål i celleprøver fastgjort på en fast bærer.

Denne teknik involverer mikroskopisk observation med immunologisk specificitet, hvilket gør det muligt at observere levende eller døde celler, der kan præsentere mindre mængder antigener. Det er vidt brugt både inden for forskning og til klinisk diagnose af forskellige patologier.

Immunmærkning af actinfilamenter i cardiomyocytceller (Kilde: Ps1415 via Wikimedia Commons)

Denne teknik, hovedsageligt kvalitativ (med nogle kvantitative varianter), har specifikt at gøre med visualiseringen af ​​en prøve ved produktsignalet fra en fluorofor, som er et fluorescerende molekyle bundet til et antistof, og som er i stand til at blive exciteret ved en bestemt bølgelængde.

I cellulær sammenhæng er det meget nyttigt at undersøge tilstedeværelsen / fraværet og subcellulær placering af proteiner. Teknikken blev oprindeligt anvendt i den kliniske indstilling til diagnosticering af vira, såsom influenza og derefter til mange andre infektionssygdomme.

Det er en meget følsom teknik, og med det passende mikroskopiudstyr kan det have en meget god opløsning. Det kræver, for dets observation, brug af konfokale eller epifluorescensmikroskoper.

På trods af at den er meget populær, kan den dog byde på nogle vigtige problemer med hensyn til at opnå ikke-specifik fluorescens, der genererer en vis baggrunds "støj", hvilket ofte begrænser den tilstrækkelige læsning af resultaterne.

Basis

Immunfluorescens er baseret på udnyttelse af det biologiske fænomen i interaktionsreaktionen mellem et antistof og et antigen. Det har specifikt at gøre med visualisering eller påvisning af denne reaktion ved hjælp af spændende fluorescerende molekyler til en bestemt bølgelængde.

Et antistof er et immunoglobulinprotein, der udskilles fra aktive B-celler, der specifikt dannes mod et antigen, hvortil det kan binde med stor affinitet og specificitet. Immunfluorescens gør brug af IgG-immunglobuliner, som findes opløselige i blodserum.

Antistoffer er molekyler op til 950 kDa bestående af to korte (lette) og to lange "Y" -formede (tunge) peptidkæder. Både de lette og tunge kæder er opdelt i to domæner: den ene variabel, der er i stand til at genkende antigenet, og den anden konstant eller konserveret, karakteristisk for hver art.

Antigener er funktionelt defineret som molekyler, der kan genkendes af et antistof og er for det meste proteiner. Når et dyr udsættes for et antigen, aktiveres lymfocytterne i immunsystemet, hvilket producerer specifikke antistoffer mod det, og det fungerer som et forsvarssystem.

Et antigen, såsom et protein, kan for eksempel have mere end en epitop eller genkendelsessted ved et antistof, således at serumet fra dyret, der udsættes for et antigen, kan have polyklonale antistoffer mod forskellige regioner af det samme protein.

Immunfluorescens udnytter derefter et dyrs evne til at producere polyklonale antistoffer mod et specifikt antigen for at rense det og derefter bruge det til påvisning af det samme antigen i andre sammenhænge.

Blandt de fluorescerende farvestoffer eller molekyler, der er mest anvendt til nogle immunofluorescens-teknikker, er fluoresceinisothiocyanat (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanat-5 og 6 (TRITC), mange cyaniner såsom Cy2, Cy3, Cy5 og Cy7 og farvestoffer kaldet Alexa Fluor®, såsom Alexa Fluor®448.

protokol

Immunfluorescensprotokollen varierer afhængigt af mange faktorer, men generelt set omfatter den en lineær sekvens af trin, der består af:

• Fremstilling af plader og celler
• Fixering af prøver
• permeabilisering
• Blokering
• Immunfarvning eller immunfarvning
• Montering og observation

-Forberedelse

Af prøverne

Forberedelsen af ​​prøverne afhænger af deres art og den type erfaring, der skal udføres. Det enkleste tilfælde, der involverer anvendelse af celler i suspension, vil blive forklaret nedenfor.

Celler i suspension, det vil sige i et flydende kulturmedium, skal først adskilles fra det ved centrifugering og derefter vaskes med en pufferopløsning eller en isosmotisk "puffer", som bevarer deres integritet.

Normalt anvendes en phosphat-saltbuffer kendt som PBS, hvor cellerne resuspenderes, og denne blanding centrifugeres igen for at opnå cellerne fri for kulturmediet, som kan indeholde interfererende stoffer.

Af knivene

Objektglassene, der anvendes til mikroskopisk observation, hvor cellerne senere vil blive fikseret til de tilsvarende nedstrømsbehandlinger, skal også forberedes omhyggeligt.

Disse er dækket eller "sensibiliseret" med en opløsning af poly-lysin, en syntetisk polymer, der vil fungere som en "molekylær lim" mellem cellerne og den faste bærer takket være den elektrostatiske interaktion mellem de positive ladninger af deres aminogrupper og negative ladninger på proteinerne, der belægger celler.

Fixering af prøver

Denne proces består i at immobilisere de proteiner, der findes inde i cellen for at holde deres geografiske placering intakt. De anvendte molekyler skal være i stand til at krydse alle typer cellemembraner og danne gitter med de kovalente proteiner.

Formaldehyd og paraformaldehyd, glutaraldehyd og endda methanol er vidt brugt, hvormed celleprøver inkuberes i et bestemt tidsrum og vaskes derefter med en isosmotisk pufferopløsning.

Efter fixering af cellerne fortsættes de med at fastgøres til de ark, der tidligere var sensibiliserede med poly-lysin.

permeabilisering

Afhængig af typen af ​​test, der er udført, vil det være nødvendigt at permeabilisere cellerne, der undersøges, eller ej. Hvis det, der søges, er at kende placeringen, tilstedeværelsen eller fraværet af et bestemt protein på celleoverfladen, er permeabilisering ikke nødvendig.

På den anden side, hvis du vil vide placeringen af ​​et protein inde i cellen, er permeabilisering essentiel og vil bestå af inkubering af prøverne med Triton X-100, et detergent, der er i stand til at permeabilisere cellemembraner.

Blokering

Et grundlæggende trin i alle immunologiske teknikker er blokering. På dette trin af proceduren består blokeringen af ​​at på de sensibiliserede ark dække alle steder med poly-lysinmolekyler, som cellerne ikke klæbede til. Det vil sige, det forhindrer enhver ikke-specifik union.

Normalt anvendes opløsninger med bovint serumalbumin (BSA) i PBS-puffer til blokering, og de bedste resultater opnås, jo længere inkubationstid med denne opløsning. Efter hvert trin, inklusive blokering, er det nødvendigt at vaske den resterende opløsning af.

Immunfarvning eller immunfarvning

Immunfarvning eller immunfarvningsprocedure afhænger hovedsageligt af, om det er en direkte eller indirekte immunfluorescens (se nedenfor).

Hvis det er en primær eller direkte immunofluorescens, inkuberes prøverne med de ønskede antistoffer, som skal kobles til de fluorescerende farvestoffer. Inkubationsproceduren består i at fremstille en fortynding af antistoffet i en opløsning, der også vil indeholde BSA, men i en lavere andel.

Når tilfældet er tilfældet med en sekundær eller indirekte immunofluorescens, skal der udføres to på hinanden følgende inkubationer. Først med de ønskede antistoffer og derefter med de antistoffer, der er i stand til at detektere de konstante regioner af de primære immunoglobuliner. Det er disse sekundære antistoffer, der er kovalent bundet til fluoroforer.

Teknikken er meget alsidig, hvilket tillader samtidig mærkning af mere end et antigen pr. Prøve, så længe der er primære antistoffer koblet til forskellige fluoroforer, i tilfælde af direkte immunofluorescens.

Til samtidig mærkning i indirekte immunofluorescens er det nødvendigt at sikre, at hvert primært antistof produceres i et andet dyr, såvel som at hvert sekundært antistof er koblet til en anden fluorophore.

Som blokering giver inkubation med antistoffer bedre resultater, jo længere tid dette er. Efter hvert trin er det nødvendigt at vaske de overskydende antistoffer, der ikke binder til prøverne, og i den sekundære immunofluorescens er det nødvendigt at blokere, før det sekundære antistof tilsættes.

Visse teknikker bruger andre pletter, der ikke er relateret til immunfarvning, såsom farvning af nuklear DNA med DAPI fluorophore.

Montering og observation

I den sidste inkubationstid med fluoroforerne er det nødvendigt, at prøverne forbliver i mørke. Til observation under mikroskopet er det almindeligt at bruge nogle stoffer til at bevare fluorescensen af ​​fluoroforerne koblet til antistofferne.

typer

Grafisk oversigt over direkte og indirekte immunofluorescens (Kilde: Westhayl618 via Wikimedia Commons)

Direkte eller primær immunfluorescens

Det har at gøre med påvisning af antigener ved hjælp af fluorescerende antistoffer. Den største fordel ved at bruge denne teknik er dens hastighed, men mange tilfælde af ikke-specifik binding kan forekomme i processen, især når man studerer humane sera, da de er rige på meget heterogene antistoffer.

Indirekte eller sekundære immunofluorescenser

Det er også kendt som "sandwich" -teknikken, og dette involverer udviklingen af ​​teknikken i to trin. Det første har at gøre med anvendelsen af ​​et ikke-fluorescerende antistof og dets binding til antigenet af interesse.

Mod det konstante område af dette første antistof (som nu vil fungere som antigen) anvendes et andet antistof, der er i stand til at genkende det, som er forbundet med et fluorescerende molekyle.

Udseendet af et fluorescerende signal vil være resultatet af specifik genkendelse mellem det første ikke-fluorescerende antistof og antigenet af interesse; tilstedeværelsen af ​​dette første antistof betingelser for det af det andet, der er mærket, og takket være hvilket tilstedeværelsen eller fraværet af antigenet kan bestemmes.

På trods af at det er en meget mere tidskrævende teknik end direkte immunofluorescens (da den inkluderer endnu et inkubationstrin), involverer denne teknik ikke designet af et fluorescerende antistof for hvert antigen, der undersøges, hvilket resulterer i økonomiske termer, mere levedygtig.

Det er endvidere en mere følsom teknik med hensyn til signalforstærkning, da mere end et sekundært antistof kan binde til det konstante område af det primære antistof og således forstærke intensiteten af ​​det fluorescerende signal.

Applikationer

Som det tidligere er blevet bemærket, er immunofluorescens en ekstrem alsidig teknik, der er blevet anvendt på mange måder inden for det videnskabelige og kliniske område. Det kan bruges til at besvare økologiske, genetiske og fysiologiske spørgsmål vedrørende mange organismer.

Blandt de kliniske anvendelser bruges det til den direkte diagnose af nogle dermatologiske sygdomme, enten ved anvendelse af direkte eller indirekte immunofluorescens på epitelvæv hos de studerede patienter.

Immunofluorescens-teknikker har været tilgængelige i encellede organismer, såsom gær til visualisering af intranukleære og cytoplasmatiske mikrotubuli, actin og associerede proteiner, 10 nm filamenter og andre bestanddele af cytoplasma, membran og cellevægge.

Referencer

1. Abcam, immunocytokemi og protokol til immunofluorescens. Hentet fra abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluorescerende farvestoffer. Hentet fra leica-microsystems.com
3. Miller, DM, & Shakest, DC (1995). Immunofluorescensmikroskopi. I Methods in Cell Biology (Vol. 48, s. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID & Cook, D. (2013). Immunofluorescens-teknikker. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Immunofluorescensmetoder til gær. I Methods of Enzymology (Vol. 194, s. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Anvendelser af immunfluorescens i folkesundhedsvirologi. Bakteriologiske anmeldelser, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996). Immunfluorescens i fytoplankton-forskning: applikationer og potentiale. J: Phycol., 32, 1–16.